木糖醇对黏性放线菌生长及产酸影响的体外研究

郭厚佐 肖遥 廉小天 邹玲

口腔疾病研究国家重点实验室 华西口腔医院（四川大学），成都 610041

木糖醇是木糖代谢的正常中间产物，长期食用含木糖醇的食品可以明显降低各类龋坏的发病率，减少口腔中变异链球菌的数量[1-2]。体外研究[3]表明，木糖醇对于口腔牙菌斑生物膜形成有抑制作用，但具体机制不明。黏性放线菌是口腔固有菌群的主要成员，能发酵多种碳水化合物产酸，对牙面尤其是牙骨质具有极强的黏附能力，在根面牙菌斑形成过程中发挥重要作用。目前研究[4-5]认为，黏性放线菌的黏附以及产酸能力可能与根面龋的发生有密切关系。目前木糖醇对黏性放线菌的黏附及产酸能力影响的报道还较少，本实验采用生长曲线测量和pH值检测分析木糖醇对黏性放线菌的影响，探索采用木糖醇防治龋病的新途径。

1 材料和方法

1.1 实验菌株、仪器及培养基制备

1.1.1 实验菌株 黏性放线菌ATCC 15987由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供。

1.1.2 实验仪器 厌氧培养箱（浙江义乌冷冻机总厂），METTLER TOLEDO FE20型pH计（Mettler Toledo公司，瑞士），电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），TDL-40B型低频离心机（上海安亭科学仪器厂），BHC-1300ⅡA/B3型生物洁净安全柜（苏州净化设备有限公司），AUTOCLAVE MLS-3780型高压灭菌机（Sanyo公司，日本），SPECTRONIC 200分光光度仪（Thermo Scientific公司，美国）。

1.1.3 木糖醇-BHI液体培养基配制 在脑心浸液（brain heart infusion，BHI）液体培养基中分别加入木糖醇粉末，调整其质量浓度为128 g·L-1，用NaOH溶液和HCl溶液调节pH值至7.40。配置200 mL上述木糖醇-BHI液体培养基，另配置200 mL纯BHI液体培养基，调节pH值至7.40，立即置于121 ℃、133 MPa条件下消毒2 h，备用。

1.2 实验方法

1.2.1 实验菌株的复苏以及培养 黏性放线菌ATCC 15987冻干菌株复苏48 h后，采用平板划线法将其接种于BHI琼脂培养基中，37 ℃厌氧条件（80% N2、10% H2、10% CO2）下培养48 h，挑取单菌落经形态学及生化鉴定为纯培养物后，将菌落接种于BHI液体培养基中，厌氧培养48 h，将菌液在4 ℃下以4 000 r·min-1离心5 min，PBS（pH=7.40）缓冲液洗菌2次，用比浊仪在BHI液体培养基中调整菌悬液密度至0.5 McFarland（1×108CFU·mL-1），备用。

1.2.2 最小抑菌质量浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）的测量 本实验共分为7组，6个实验组和1个对照组。实验组：含不同质量浓度木糖醇的BHI培养基+菌悬液，对照组：BHI液体培养基+菌悬液。

用无菌BHI液体培养基按对倍稀释法将已配制好的木糖醇-BHI培养基稀释为128、64、32、16、8、4 g·L-1共6个质量浓度梯度，外加纯BHI液体培养基，过滤除菌后各取100 μL加入96孔板中。每个孔取100 μL菌悬液加入96孔板置于微型振荡器上振荡混匀1 min，37 ℃厌氧培养48 h，使用HTS 7000 Plus多孔板高效分析仪测量550 nm波长下的吸光度，测定黏性放线菌的生长情况。上述实验重复3次，每次均设3组平行实验组。与对照组相比，能抑制90%细菌生长的最低实验药物质量浓度即为MIC。

1.2.3 木糖醇对黏性放线菌产酸能力的影响 取菌悬液与通过二倍稀释法得到的不同梯度浓度的木糖醇-BHI培养基各1 mL，接种于无菌15 mL离心管内，使管中木糖醇质量浓度分别达到1/2、1/4、1/8 MIC和MIC，且细菌终密度均为5×107CFU·mL-1。调整各组初始pH值至7.40，37 ℃厌氧培养48 h，分别于1.5、3、6、12、24、48 h在无菌环境下测量培养物上清液pH值，并计算pH变化值ΔpH，ΔpH=初始pH-终末pH，其初始pH值为7.40。上述实验重复3次，每次均设3组平行实验组。

1.2.4 木糖醇对黏性放线菌生长的影响 取通过二倍稀释法得到的不同浓度梯度的木糖醇-BHI培养基各3 mL，加入玻璃试管内，使管中木糖醇质量浓度分别达到1/2、1/4、1/8 MIC和MIC。用无菌BHI液体培养基调整菌悬液密度至1×106CFU·mL-1，并于每个玻璃管中添加300 μL，于振荡器上混匀，并调整pH值至7.40，37 ℃厌氧培养12 h。于2、4、6、8、10、12 h用SPECTRONIC 200分光光度仪测量每个试管550 nm下的光密度（optical density，OD）值，记录数据。上述实验重复3次，每次均设3组平行实验组。

1.2.5 木糖醇对黏性放线菌黏附能力的影响 取通过二倍稀释法得到的不同梯度质量浓度的木糖醇-BHI培养基各200 μL加入96孔板中，使孔中木糖醇质量浓度分别达到128、64、32、16、8 g·L-1。调整菌悬液密度至5×105CFU·mL-1，每个孔加入20 μL菌悬液并置于微型振荡器上振荡混匀1 min，37 ℃厌氧培养48 h，结晶紫生物膜染色后于HTS 7000 Plus多孔板高效分析仪测量595 nm波长下的吸光度，测得最低抑制生物膜形成质量浓度（minimum biofilm inhibition concentration，MBIC）。将MBIC定义为：与对照组相比，能抑制50%（MBIC50）或90%（MBIC90）黏性放线菌生物膜形成的最低药物质量浓度。

1.2.6 数据分析 使用SPSS 19.0统计软件，采用单因素方差分析进行分析，若差异有统计学意义，采用单因素方差分析Dunnett检验进一步比较各实验组间及实验组与对照组间的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 MIC测量结果

木糖醇能抑制黏性放线菌生长，MIC为64 g·L-1。

2.2 木糖醇对黏性放线菌产酸能力的影响

不同质量浓度木糖醇培养基在不同培养时间的ΔpH值见表1。前3 h对照组及各实验组ΔpH值的差异无统计学意义（P>0.05）。培养6 h时，对照组与1/8 MIC的ΔpH值的差异无统计学意义，但对照组与剩余各实验组的差异均有统计学意义（P<0.05）。培养12 h，各组间ΔpH值的差异都有统计学意义（P<0.01），且随木糖醇质量浓度升高ΔpH值降低，说明1/2、1/4、1/8 MIC以及MIC质量浓度的木糖醇培养基均在短时间内可抑制黏性放线菌产酸，且质量浓度越高对黏性放线菌产酸的抑制作用越明显。培养48 h，对照组、1/8 MIC、1/4 MIC的ΔpH值的差异无统计学意义（P>0.05），但相较1/2 MIC、MIC的ΔpH值的差异有统计学意义（P<0.01），提示1/2MIC及MIC质量浓度的木糖醇培养基可较长久地抑制黏性放线菌产酸。

表1 不同质量浓度木糖醇对黏性放线菌产酸的影响Tab 1 Effect of xylitol concentration on Actinomyces viscosus acid production ±s

表1 不同质量浓度木糖醇对黏性放线菌产酸的影响Tab 1 Effect of xylitol concentration on Actinomyces viscosus acid production ±s

组别 1.5 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h对照 0.10±0.037 0.29±0.080 0.74±0.041 1.50±0.043 2.37±0.033 2.66±0.033 1/8 MIC 0.17±0.028 0.25±0.060 0.72±0.055 1.34±0.053 2.35±0.028 2.66±0.037 1/4 MIC 0.13±0.032 0.14±0.061 0.44±0.057 0.87±0.041 2.26±0.069 2.64±0.045 1/2 MIC 0.16±0.056 0.16±0.043 0.44±0.065 0.63±0.044 1.62±0.049 2.50±0.033 MIC 0.12±0.090 0.20±0.089 0.43±0.031 0.52±0.041 0.93±0.058 1.77±0.065

2.3 木糖醇对黏性放线菌生长的影响

不同质量浓度木糖醇培养基在不同培养时间的OD550测量值见表2。前6 h内各组OD550的差异无统计学意义（P>0.05），此为细菌生长的迟缓期，OD550测量值并无明显变化。6～12 h，对照组与各实验组OD550的差异均有统计学意义（P<0.05），说明1/2、1/4、1/8 MIC以及MIC质量浓度的木糖醇培养基对黏性放线菌对数期的生长有明显的抑制作用。培养12 h，除1/2 MIC及MIC组之外，其余各组的OD550差异无统计学意义（P>0.05），说明黏性放线菌的生长在1/2 MIC及MIC木糖醇培养基中将受到较长久的抑制。

表2 不同质量浓度木糖醇对黏性放线菌生长的影响Tab 2 Effect of xylitol concentration on Actinomyces viscosus growth ±s

表2 不同质量浓度木糖醇对黏性放线菌生长的影响Tab 2 Effect of xylitol concentration on Actinomyces viscosus growth ±s

组别 2 h 4 h 6 h 8 h 10 h 12 h对照 0.038±0.017 0.157±0.015 0.357±0.033 0.511±0.030 1.054±0.026 1.750±0.075 1/8 MIC 0.059±0.008 0.127±0.054 0.272±0.035 0.388±0.045 0.769±0.072 1.517±0.136 1/4 MIC 0.070±0.067 0.131±0.018 0.262±0.037 0.441±0.067 0.854±0.025 1.490±0.021 1/2 MIC 0.057±0.010 0.106±0.009 0.173±0.007 0.286±0.078 0.462±0.121 0.665±0.004 MIC 0.053±0.014 0.090±0.089 0.115±0.024 0.167±0.046 0.187±0.049 0.229±0.087

2.4 木糖醇对黏性放线菌黏附能力的影响

木糖醇能够抑制黏性放线菌生物膜的形成，其MIBC50为64 g·L-1，MIBC90为128 g·L-1。

3 讨论

现代口腔生态学观点认为：黏性放线菌等致龋相关菌通常为口腔内常驻菌，龋病的发生是口腔微生态系统失衡的结果[6]。正常条件下，通过唾液分泌等口腔内各类缓冲作用，口腔pH值可维持在5.6～7.6的中性范围内[7]。当口腔内致龋菌于菌斑中代谢碳水化合物产酸，降低菌斑pH值至5.5以下时，釉质的脱矿和再矿化平衡就会被打破，牙体硬组织脱矿，龋损形成。黏性放线菌的致病性主要表现在对牙面的黏附，以及产酸和耐酸，而且近年来有学者[8]指出其在厌氧环境下的产酸能力被低估了。

本研究选用木糖醇进行抑菌效果检测。目前国内外的研究普遍认为，木糖醇能有效防龋，主要原因有如下两点。第一，阻止菌斑细菌代谢产酸。由于木糖醇不能被菌斑细菌所分解代谢，口腔内的微生物无法利用其产酸，因此菌斑的产酸量下降，有助于脱矿釉质再矿化，降低龋的发生。第二，促进再矿化形成。咀嚼无糖口香糖可刺激唾液分泌，增加唾液中各类缓冲体系的缓冲效果，使缓冲能力增强[9]，pH值升高，有利于牙齿硬组织的再矿化。

本研究结果显示，当木糖醇质量浓度高于64 g·L-1时，木糖醇对黏性放线菌的抑制效果明显，黏性放线菌基本不在这种环境中生长。当木糖醇质量浓度低于64 g·L-1时，对黏性放线菌的生长及产酸仍有一定程度的抑制作用，但随质量浓度的下降，木糖醇对黏性放线菌的抑制效果逐渐减弱。这些结果提示，木糖醇能有效地抑制黏性放线菌的生长、黏附以及产酸，有一定的抑制致龋菌的效果。

[1]Alanen P, Isokangas P, Gutmann K. Xylitol candies in caries prevention: results of a field study in Estonian children[J].Community Dent Oral Epidemiol, 2000, 28(3):218-224.

[2]Hayes C. The effect of non-cariogenic sweeteners on the prevention of dental caries: a review of the evidence[J]. J Dent Educ, 2001, 65(10):1106-1109.

[3]Badet C, Furiga A, Thébaud N. Effect of xylitol on anin vitromodel of oral biofilm[J]. Oral Health Prev Dent, 2008,6(4):337-341.

[4]Schüpbach P, Osterwalder V, Guggenheim B. Human root caries: microbiota of a limited number of root caries lesions[J]. Caries Res, 1996, 30(1):52-64.

[5]李鸣宇, 刘正, 马瑞, 等. 根面龋细菌学初步分析[J]. 临床口腔医学杂志, 2004, 20(4):226-227.

[6]ten Cate JM. Biofilms, a new approach to the microbiology of dental plaque[J]. Odontology, 2006, 94(1):1-9.

[7]Ruhl S. The scientific exploration of saliva in the post-proteomic era: from database back to basic function[J]. Expert Rev Proteomics, 2012, 9(1):85-96.

[8]赵丽娟. 粘性放线菌与龋病关系的研究现状[J]. 国外医学口腔医学分册, 1995, 22(3):171-174.

[9]Edgar WM. Sugar substitutes, chewing gum and dental caries—a review[J]. Br Dent J, 1998, 184(1):29-32.