雷公藤内酯对老年大鼠术后认知功能障碍海马TNF-α表达的影响

商雄跃，高铁梅，褚庆霞

(江苏省南京市浦口区中心医院1.重症医学科;2.麻醉科;3.呼吸内科，江苏南京 211800)

术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是指手术麻醉后数天内发生的一种可逆的、具有波动性的急性精神紊乱综合征［1］。临床上术后认知功能障碍比较常见，特别是老年人发病率较高，但病因、病情复杂多样，容易受到忽视。术后认知功能障碍可导致患者康复延迟、住院天数延长和医疗费用增加等，严重时甚至影响病人出院后的生活质量。

研究发现，炎症反应在POCD的病理改变过程中是关键因素，非甾体抗炎药物可以降低围术期炎症反应，改善大鼠的学习与记忆能力。抑制炎症反应对神经组织细胞的损害可能成为POCD防止的重要手段［2－3］。

雷公藤内酯(tripterygium glycosides，TP)是卫矛科植物雷公藤的去皮根部提取的环氧化二萜内酯类化合物，具有较强的抗炎、免疫抑制作用，且能通过血脑屏障，已成功用于类风湿性关节炎、红斑狼疮等自身免疫性炎症性疾病［4－6］。目前关于雷公藤内酯对于POCD的作用报道甚少。本实验通过观察雷公藤内酯对肝部分切除术后老年大鼠海马TNF-α表达影响，为将来将TP用于POCD的防治提供可能的实验基础。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂 健康SD大鼠56只，雌雄不限，20月龄，体重500～600 g，由徐州医学院实验动物中心提供，动物许可证号:2112379。Y型迷宫为张家港生物医学仪器厂生产。雷公藤内酯由西安昊轩生物科技有限公司生产，纯度＞98%。

1.2 实验分组和动物模型的建立 用Y型迷宫初筛，去除对电击耐受性差和对电击不敏感的大鼠，按照随机数字表法，将入选大鼠随机分为3组:假手术组(sham组)(n=14)，模型组(POCD组)(n=21)和TP给药实验组(TP组)(n=21)。实验组术前1 d、手术当日和术后1 d腹腔注射TP 0.4 mg·kg－1，共3次。假手术组和模型组腹腔注射等容积的4%丙二醇溶液。禁食12 h，自由饮水。假手术组行麻醉后打开腹腔不予肝脏部分切除;其余大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg·kg－1，翻正反射消失后仰卧位固定，碘氟消毒后在剑突下腹部正中线切开1.5～2.0 cm切口，进入腹腔分离左侧叶肝脏，在远端蒂部用1号丝线结扎后切除肝左叶。止血后逐层关腹。

1.3 认知功能测试 术后1、7 d时各取7只大鼠，采用Y型迷宫检测术后第1、2、3、7、8、9天时的学习记忆能力。实验时先将大鼠放入迷宫中适应3～5 min，然后以无规则次序变换安全区，以训练大鼠辨别灯光刺激及安全方位的能力。每个实验日对每只大鼠进行20次训练，以大鼠在足底通电后10 s内一次性跑向安全区为正确反应，否则为错误反应。于每天19:00～22:00进行Y型迷宫实验，采用固定次数随机不休息法记录大鼠全天总反应时间(一个实验日大鼠完成20次反应所需时间，total reaction time，TRT)、每天出现错误反应的次数(error number，EN)和主动回避次数(active avoidence times，AAT)［7－8］。

1.4 免疫组织化学染色及图像分析 术后第3天时各取7只大鼠，大鼠经升主动脉插管，4%多聚甲醛(4℃，pH 7.4)灌注固定，在大脑海马区连续冠状面冰冻切片，片厚25 μm，进行免疫组织化学染色。30%过氧化氢1份+纯甲醇50份混合，室温浸泡30 min。蒸馏水洗后滴加5%BSA封闭液，室温20 min。甩去多余液体，滴加兔抗TNF-α抗体，4℃过夜。PBS洗涤2 min 3次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，20～37℃ 20 min。PBS洗 2 min 3次。滴加试剂 SABC，20～37℃，20 min。PBS洗5 min 4次。DAB显色，阳性细胞浆着色呈棕黄色。每只大鼠取3张切片，每张切片随机取3个不同视野，采用纤维图像分析系统(×100)测出TNF-α阳性细胞数和平均光密度。

2 结果

2.1 认知功能测试的结果 与假手术组比较，POCD组大鼠术后1 d全天总反应时间、错误反映次数、主动回避次数无明显统计学差异(P＞0.05)，术后7 d全天总反应时间、错误反映次数、主动回避次数发生明显改变(P＜0.05)。与模型组比较，实验组大鼠术后8 d全天总反应时间明显缩短(P＜0.05)，术后 2、3、7、8、9 d 错误反映次数明显减少(P ＜0.05)，术后2、3、7、8 d 主动回避次数明显增加(P ＜0.05)。见表1。

表1 肝部分切除术后各组大鼠学习记忆能力的比较(±s)

表1 肝部分切除术后各组大鼠学习记忆能力的比较(±s)

注:*与模型组比较，P ＜0.05:△与假手术组比较，P ＜0.05。

主动回避次数假手术组 —组别 术后 全天总反应时间/min错误反映次数6.2 ±1.7 9.6 ±2.2 1.4 ±0.4模型组1 d 5.4 ±1.6 1 0.8 ±2.5 0.9 ±0.7 2 d 4.7 ±0.4 7.1 ±2.3 3.5 ±0.9 3 d 4.7 ±0.4 5.4 ±2.1 4.5 ±1.2 7 d 4.9 ±0.5△ 6.7 ±2.1△ 3.8 ±0.7△8 d 4.7 ±0.8 6.3 ±1.8 3.7 ±1.1 9 d 4.5 ±0.3 2.7 ±0.8 6.7 ±1.3实验组7.0 ±1.4 1 d 6.6 ±1.3 9.5 ±2.3 1.0 ±1.1 2 d 5.6 ±1.7 3.1 ±1.1* 6.7 ±1.1*3 d 5.2 ±1.2 2.2 ±0.7* 7.2 ±1.9*7 d 4.9 ±0.8 3.1 ±0.7* 6.4 ±0.9*8 d 3.7 ±0.7* 3.6 ±0.8* 6.5 ±1.5*9 d 2.9 ±0.6* 1.7 ±0.5*

2.2 免疫组织化学染色及图像分析 与假手术组比较，模型组大鼠海马区TNF-α阳性细胞数和平均光密度明显增加(P＜0.05);与模型组比较，实验组大鼠海马区TNF-α阳性细胞数和平均光密度明显降低(P＜0.05)。见表2。

3 讨论

重大手术创伤导致患者免疫系统的激活，引起神经系统中炎性细胞因子(IL-1、IL-2、TNF)的释放，造成中枢Ach、5-HT和NE等递质系统的紊乱，导致中枢神经系统发生炎症反应，通过炎症因子介导从而造成与海马功能变化相关的POCD［9］，神经元、小胶质细胞和外周可迅速释放白细胞介素IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子(TNF-α)等多种炎症因子，可引起其他炎症介质渗透到脑损伤部位，激活次级信号转导通路，引起级联放大效应，其中TNF-α可能发挥了相对重要作用。

表2 各组大鼠海马TNF-a阳性细胞数和平均光密度值(n=5，±s)

表2 各组大鼠海马TNF-a阳性细胞数和平均光密度值(n=5，±s)

注:与假手术组比较，*P ＜0.05:与模型组比较，△P ＜0.05。

组别 阳性细胞数 平均光密度值假手术组1 9.8 3 ±4.1 0.2 5 2 ±0.0 1 4模型组 64.7 5 ±1 1.34* 0.3 93 ±0.0 2 1*实验组 5 1.6 3±7.47△ 0.3 5 1±0.0 1 6△

TNF-α是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，是一种多效性炎症因子，对机体中几乎所有器官都能产生效应。急慢性机体炎症反应使促炎症因子TNF-α的表达，并可通过炎症免疫应答对大脑产生影响。最新的研究发现TNF-α具有调节炎症反应与大脑功能，过多的TNF-α表达可致大鼠认知功能发生衰退。通过抗TNF-α治疗并与对照组比较，认知功能有明显的改善。本实验中，模型组大鼠海马区TNF-α阳性细胞数和平均光密度与假手术组比较明显增加(P＜0.05)，提示TNF-α的高表达对认知功能障碍的形成起着重要作用。

本实验中，模型组大鼠术后1 d全天总反应时间、错误反映次数、主动回避次数与假手术组比较无明显统计学差异(P＞0.05)，可能与戊巴比妥钠的麻醉残留作用有关。术后7 d全天总反应时间、错误反映次数、主动回避次数与假手术组比较发生明显改变(P＜0.05)，表明肝部分切除术后，模型组大鼠产生了认知功能障碍，本实验建立模型是成功的。

中枢神经系统(central nervous system，CNS)虽然可以对创伤、应激和感染做出防御反应，但是可能存在延迟，不像外周组织那样迅速产生粒细胞趋化和聚集。由于血脑屏障的保护作用，一般情况下仅T淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞进入脑组织，炎症因子的表达水平和活性均较低。因此，以往观点认为大脑是免疫特赦(immune privilege)器官。雷公藤内酯(tripterygium glycosides，TP)能通过血脑屏障，对炎症早期毛细血管通透性增加引起的渗出和水肿有明显抑制作用。本实验中，实验组大鼠术后8 d全天总反应时间明显缩短(P ＜0.05)，术后2、3、7、8、9 d 错误反映次数明显减少(P ＜0.05)，术后 2、3、7、8 d主动回避次数明显增加(P ＜0.05)，表明雷公藤内酯明显减轻肝部分切除术后大鼠认知功能障碍。

本实验中，模型组大鼠海马区TNF-α阳性细胞数和平均光密度与假手术组比较明显增加(P＜0.05)，实验组大鼠海马区TNF-α阳性细胞数和平均光密度与模型组比较明显降低(P＜0.05)，提示雷公藤内酯明显减轻肝部分切除术后大鼠认知功能障碍可能与其通过抑制炎症反应，减少TNF-α表达有关。

本实验表明TNF-α与POCD的发生有相关性，并支持着POCD是炎症性疾病的可能机制。但 TNF-α是否在POCD的发生中起决定性的独立因素及其表达水平的减低是否能使POCD的发生率减小，还有待于进一步研究。

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