维药肉桂子体外抗氧化活性研究

胡曙晨，马雪红，李新霞，李 莉，热娜·卡斯木，支 玲

(新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐 830011)

肉桂子(Fructus cinnamomi cassiae immaturi)系樟科植物肉桂(Cinnamomum cassia presl)的干燥带宿萼的未成熟果实［1］。肉桂子以全粒入药，是维吾尔医习用的药材，用于治疗湿寒性或黏液质性心脏和肠胃疾病，在新疆各地的维吾尔医院有长期的应用历史。肉桂子亦可作为成方制剂用于治疗男性前列腺炎、肾炎、缺血性心脑血管疾病、肠胃疾病，还可用来预防家禽瘟疫。

自由基学说是20世纪50年代中期由著名学者Harman首先提出，是具有代表性的致衰学说之一［2］。自由基能够独立存在，在机体内有很强的氧化反应能力，是机体正常代谢的中间产物，易产生连锁反应，对蛋白质、核酸、脂质等产生伤害作用，从而导致机体损伤［3］。近年随着对自由基研究的深入，人体内自由基被认为是引发癌变、衰老和细胞损伤的重要原因，因而具有清除自由基能力的天然抗氧化剂也越来越受到众多学者的亲睐。迄今为止，用于评价植物抗氧化能力的方法有很多，如硫氰酸盐法、硫代巴比妥酸法、抗氧化能力指数法、化学发光法、荧光法、高效液相色谱法等，还有很多清除自由基的检测评价方法，这些方法都各有利弊。目前常用于评价抗氧化活性的方法有1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)法，羟基自由基(·OH)法。

国内对于肉桂子药理活性方面的研究较少，赵晨等使用DPPH方法和脂质过氧化方法检测了肉桂子、花椒挥发油的抗氧化活性，通过和阳性对照维生素E和维生素C的比较，发现两种植物挥发油均有不同程度的抗氧化活性，花椒的抗脂质过氧化活性和清除自由基活性均强于肉桂子［4］。

本文以紫外可见分光光度法对维药肉桂子提取物进行抗氧化能力测定，初步评价其抗氧化活性，以期为其药用价值的开发和发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 原料:维药肉桂子四批次(分别购买于广西桂林，越南，和田和伊犁汉人街市场)。

试剂:DPPH(Solarbio，Cat No.D0909)，维生素C(国药集团新疆制药有限公司)，邻二氮菲(天津市光复精细化工研究所)，磷酸、磷酸氢二钠(天津市福晨化学试剂厂)，双氧水、无水乙醇(天津市富宇精细化工有限公司)，硫酸亚铁、甲醇(天津市福晨化学试剂有限公司)，双蒸水。

仪器:紫外可见分光光度计(UV-2550，JAPAN);超声波清洗仪(500 W，40 kHz，昆山市超声仪器有限公司);高速万能粉碎机(北京市永光明医疗仪器厂);分析天平(Mettler-Teledo，AB135-S，d=0.01/0.1 mg);分析天平(BL150，北京赛利多斯);电热恒温水浴锅(DK-S24型，上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 供试品溶液的制备 称取肉桂子粉末2.5 ～5.0 g，置于100 mL 锥形瓶中，加甲醇50 mL，超声30 min，过滤，定容至100 mL容量瓶，作为供试品溶液备用。

1.2.2 肉桂子提取物对 DPPH 清除率的测定［5－6］

(1)DPPH溶液稳定性实验:DPPH·是一种稳定的自由基，其甲醇溶液呈紫色，在517 nm附近有强吸收，当DPPH·溶液中加入自由基清除剂时，孤对电子被配对，颜色由紫色向黄色变化，在517 nm处的吸光度变小，而吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈定量关系，可用清除率(Inhibition percent，IP)表示，IP值越大，抗氧化能力越强。

研究DPPH自由基测定体系在肉桂子提取物作用下吸光度(A)随时间的变化规律，结果见图1。加入肉桂子提取物溶液(0.025 g·mL－1)后，测定吸光度A与时间的关系，由图可看出:A值在最初的5 min内下降较快;在10～15 min内，反应体系A值变化趋于平缓;10 min后A值相对稳定。故测定时选择DPPH与肉桂子提取物反应时间为10 min。

图1 肉桂子提取物与DPPH反应吸光度时间曲线

(2)肉桂子提取物清除DPPH活性测定:分别配置系列浓度供试品溶液，分别吸取(0.08 g·mL－1)DPPH甲醇溶液2 mL，各加肉桂子系列溶液1 mL于同一具塞试管，摇匀，在黑暗中放置10 min，在516 nm处测定吸光度Ai;以1 mL甲醇代替1 mL样品溶液测得吸光度值A0;以2 mL甲醇代替2 mL DPPH甲醇溶液则测得吸光度值Aj。按照公式计算清除率。

清除率S(%)=1－(Ai－Aj)/A0×100%

A0—DPPH与试样溶剂混合后的吸光度;Ai—DPPH与供试品溶液反应后的吸光度;Aj—样品与溶剂的空白吸光度。

取0.08 g·L－1浓度的DPPH溶液，以甲醇为空白，测定其在200～800 nm全波长的吸光度A0(注:当测定不同浓肉桂子提取液时，该步骤须重复)。再取各浓度肉桂子提取液，测其在全波长最大吸光波长处的吸光度Aj。而后取各浓度肉桂子提取液1 mL及浓度为0.08 g·L－1的DPPH溶液2 mL先后加入同一具塞试管，摇匀，在黑暗中放置10 min，测其在全波长最大吸光波长处的吸光度Ai。每组实验均平行三次记均值。

测定结果见表1～5，清除率趋势见图2。

表1 广西批次肉桂子提取物清除DPPH活性测定结果

表2 和田市场批次肉桂子提取物清除DPPH活性测定结果

表3 伊犁汉人街批次肉桂子提取物清除DPPH活性测定结果

表4 越南批次肉桂子提取物清除DPPH活性测定结果

表5 VC清除DPPH活性测定结果

图2 四批肉桂子提取液DPPH清除率趋势

(3)Vc对DPPH自由基清除率的测定［7］:以甲醇为溶剂，将 Vc 配成0.01，0.03，0.05，0.07，0.09，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mmol·L－1的溶液，按照(2)的方法测定其抗氧化能力，测定结果见表5，清除率趋势见图3。

图3 Vc对DPPH清除率趋势

由以上实验可知(1)通过肉桂子提取物清除DPPH活性测定法，当广西肉桂子提取物的浓度50 g·L－1，和田市场肉桂子提取物的浓度100 g·L－1，伊犁汉人街肉桂子提取物的浓度25 g·L－1，越南肉桂子提取物的浓度25 g·L－1时，其抗氧化活性都趋近最大，清除率分别达到95%，95.2%，96.5%和96.0%。而 Vc浓度为 0.088 g·L－1时，其抗氧化活性趋近最大值，清除率达到95.95%，IC50=0.012 g·L－1。(2)广西肉桂子提取物质量浓度为3.0 g·L－1时的清除率，和田市场肉桂子提取物质量浓度为1.0 g·L－1时的清除率，伊犁汉人街肉桂子提取物质量浓度为3.0 g·L－1时的清除率，越南肉桂子提取物质量浓度为3.0 g·L－1时的清除率与Vc质量浓度为0.035 g·L－1相当。(3)肉桂子提取物对DPPH的清除率表明其抗氧化能力为越南批次＜伊犁汉人街批次＜广西批次＜和田市场批次。

1.2.3 肉桂子提取物对羟基自由基(·OH)清除能力的测定［8］取1 mL 浓度为0.75 mmol·L－1的邻二氮菲无水乙醇溶液于试管中，依次加入2 mL浓度为 0.2 mol·L－1的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.40)和1 mL蒸馏水，充分混匀后，加入1 mL浓度为0.75 mmol·L－1的硫酸亚铁溶液(FeSO4)混匀，再加入1 mL浓度为0.01%的双氧水(H2O2)，于37℃水浴60 min，在510 nm处测其吸光值，所测得的数据为损伤管的吸光值(A(损));以1 mL样品液代替1 mL蒸馏水则测得样品的吸光值(A(样));用1 mL蒸馏水代替1 mL双氧水测得的吸光值为A(未)。重复3次。清除率按下式计算:清除率(%)=［(A(样)-A(损))/(A(未)-A(损)］×100%取不同批次的肉桂子分别配置为不同系列浓度，按上述方法依次测定吸光度。

测定结果见表6～9，清除率趋势见图4。

表6 伊犁汉人街肉桂子提取物对羟基自由基(·OH)清除能力的测定结果

表7 和田市场肉桂子提取物对羟基自由基(·OH)清除能力测定结果

表8 广西肉桂子提取物对羟基自由基(·OH)清除能力的测定结果

表9 越南肉桂子提取物对羟基自由基(·OH)清除能力的测定结果

图4 四批肉桂子提取液(·OH)清除率趋势

由以上实验可知，肉桂子提取物对羟基自由基(·OH)清除率能力表明其抗氧化能力为越南批次＜伊犁汉人街批次＜和田市场批次＜广西批次。

2 讨论

在肉桂子提取物DPPH清除率实验中，要注意在加入药材粉末之前，将全部仪器洗净备用，如有杂质存在会影响DPPH在紫外可见分光光度计的吸光度的测定，使实验失败。在肉桂子提取物对羟基自由基(·OH)清除能力的测定中，要注意在测定过程中使溶液在水浴锅中37℃加热60 min，时间不能缩短，一旦缩短会影响吸光度的测定。

［1］ 国家卫生部.中药材:第一册［M］.北京:人民卫生出版社，2010:36.

［2］ 曾昭惠，张宗玉.自由基对线粒体DNA的氧化损伤与衰老［J］.医学科技，1997(2):34 －36.

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［4］ 赵 晨，李 蓉，邹国林.桂丁、花椒挥发油抗氧化活性及其方法研究［J］.武汉大学学报:理学版，2008，54(4):447 －450.

［5］ 倪国柱，温琳豫，王 健，等.DPPH法测定新疆磨合烟的抗氧化活性［J］.广州化工，2012，40(22):104 －106.

［6］ 李 菁，朱艳平，陈清杰，等.茶籽壳不同部位提取物清除二苯基苦基苯肼自由基作用［J］.中国药师，2012，15(3):370 －372.

［7］ 郑大贵，叶 青，叶红德，等.DPPH·法评价Vc、异Vc及其衍生物的抗氧化性能［J］.食品工业科技，2008，29(4):113 －116.

［8］ 李 莉，孙颖平，李思栋，等.黑果小檗总黄酮含量测定及体外抗氧化活性研究［J］.安徽医药，2013，17(6):934 －936.