肺癌荷瘤小鼠体内组织中2-甲氧基雌二醇纳米混悬剂的分布*

2014-12-04 07:28韩淑萍孙惠斌王宇辉张超锋
郑州大学学报(医学版) 2014年6期
关键词:悬剂甲氧基雌二醇

贾 欣,韩淑萍,孙惠斌,王宇辉,张超锋,杜 斌

1)郑州大学药学院 郑州450001 2)郑州市第二人民医院药剂科 郑州450006

2-甲氧基雌二醇(2-ME)是一种新型甾体激素类抗肿瘤药物,目前在国外处于Ⅱ期临床研究阶段[1-2]。体内外药效学研究[3-5]表明,2-ME 对多种肿瘤细胞均有良好的抗肿瘤作用,且具有高效低毒、不易产生耐药性等特点。然而2-ME 水溶性差,口服吸收无规律,明显的首过效应[6]限制了其应用。针对这些缺点设计了供静脉注射用的2-ME 纳米混悬剂[7]。该研究中作者建立了Lewis 肺癌荷瘤小鼠模型,进一步研究2-ME 纳米混悬剂在肺癌荷瘤鼠体内组织的分布,以期为该剂型的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 药品与试剂:2-ME(纯度99%,自制),环孢素A(纯度98.5%,批号120308,武汉鑫佳灵生物科技有限公司),胎牛血清(批号1010511,美国TCB 公司),甲醇(色谱纯,德国Merck 公司),乙腈(分析纯,天津市协和昊鹏色谱科技有限公司),其他试剂均为分析纯。实验动物:SPF 级昆明种小鼠雌雄各半,(20 ±2)g,由山东鲁抗医药股份有限公司提供,动物质量合格证号SCXK(鲁)20080002。瘤株:鼠源性肺腺癌细胞株Lewis 购自上海生命科学研究院细胞资源中心。仪器:Agilent 1200 高效液相色谱仪(美国Agilent 公司),T25 数显匀浆机(德国IKA 实验技术公司),MD200-2 型氮气吹扫仪(杭州奥盛仪器有限公司),Z36HK 大容量高速冷冻离心机(德国贝托特·哈默机械制造股份公司)。

1.2 试液的配制

1.2.1 2-ME 贮备液及标准溶液的制备 精密称取2-ME 64.00 mg,置于25 mL 量瓶中,甲醇溶解稀释至刻度,配制成2.56 g/L 的2-ME 贮备液。以上述贮备液配制成质量浓度范围在0.25~256.00 mg/L的标准溶液。

1.2.2 2-ME 溶液的配制 精密称取2-ME 40.00 mg 溶于2 mL 无水乙醇中,加超纯水7 mL、聚氧乙烯氢化蓖麻油1 mL,50℃热熔搅拌0.5 h,制成质量浓度为4.00 g/L 的2-ME 溶液[8],灭菌。

1.2.3 2-ME 纳米混悬剂的制备 精密称取2-ME 32.00 mg 和卵磷脂192.00 mg,加入无水乙醇4 mL,超声使溶解,构成有机相;称取192.00 mg 泊洛沙姆188、3.20 mg 十二烷基硫酸钠及19.20 mg 羧甲基纤维素钠,溶于8 mL PBS 中,构成水相。3 000 g 磁力搅拌下将有机相缓慢滴入水相,继续搅拌30 min,充分乳化,然后常温减压旋蒸除去有机溶剂,探超30次,每次3 s,制得4.00 g/L 乳白色纳米混悬剂。

1.3 实验动物分组与处理 参照文献[9]建立Lewis 肺癌荷瘤鼠模型并将荷瘤鼠采用随机数字表法分为2组,即2-ME 纳米混悬剂组(实验组)和2-ME溶液组(对照组),每组35只。给药前禁食12 h,自由饮水。实验组小鼠尾静脉注射40 mg/kg 的2-ME 纳米混悬剂,对照组同法给予2-ME 溶液。给药5、15、30、60、120、240、480 min 后分别取5只小鼠,摘眼球取血,脱颈椎处死后,立即分离心、肝、脾、肺、肾、胃、脑及瘤组织样品,-20℃冰箱保存。精密称取各组织样品,加入生理盐水(样品质量与生理盐水体积比,肝、肾、胃、脑、瘤按1∶2,脾、心按1∶3,肺按1∶4),用组织匀浆机研磨处理,制成组织匀浆液。取组织匀浆液(肾、肺、肝、脑、脾及瘤组织取500 μL,血浆、心及胃组织取250 μL)于5 mL玻璃离心管中,加入6 倍体积的乙酸乙酯-乙腈-异丙醇(体积比为3∶2∶1),涡流混合3 min,超声10 min,4 000 g 离心15 min,取上清液,40℃下氮气流吹干,残留物加100 μL 流动相复溶,涡流振荡1 min,15 000 g 离心15 min,取上清液20 μL 进样。

1.4 色谱条件 Diamosil-C18(200 mm×4.6 mm,5 μm)为分析柱;流动相为甲醇∶水(体积比为65∶35);流速1 mL/min;柱温30℃;激发波长285 nm,发射波长325 nm;20 μL 进样。

1.5 方法学验证 标准曲线和定量限:精密量取不同质量浓度的2-ME 标准溶液,40℃氮气吹去溶媒,分别加入空白血浆及组织的空白匀浆样品,涡旋1 min 混匀,配制成不同质量浓度的标准溶液(n =3),以峰面积A 对样品中药物浓度C 进行回归,得回归方程,取S/N≥10 时样品浓度作为最低定量限。

日内精密度、日间精密度、提取回收率及方法回收率:取空白血浆和组织匀浆液,加入2-ME 溶液,配制成低、中、高3个浓度的质控样品,按1.3 处理生物样品,分别于日内测定5次计算日内精密度;连续测定5 d 计算日间精密度,并计算方法回收率及提取回收率。

1.6 数据处理和靶向性评价 采用Kinetica 4.4.1药动学软件(赛默飞世尔科技公司开发)对每个时间点血浆及各组织2-ME 的平均浓度进行分析,得AUC0-t。给药系统的靶向性评价采用相对摄取率(re)及总靶向效率(TEC)为评价参数,TEC =AUCi/∑AUC ×100%,AUCi 表示i组织的药时曲线下面积,TEC 越大,对该组织的靶向性越显著。re =(AUCi)实验组/(AUCi)对照组×100%,表示在某一组织或样本2种不同制剂的药物分布情况。

2 结果

2.1 方法学考察结果

2.1.1 色谱行为 血浆及各组织中内源性物质对样品测定无干扰,样品的保留时间为(10.28 ±0.73)min,分离度较好(图1),理论塔板数均大于4 000。

2.1.2 线性范围 结果见表1。

2.1.3 精密度与回收率 结果见表2。

2.2 组织分布结果 不同时间点2-ME 纳米混悬液和2-ME 溶液在血浆和组织中的分布情况见表3。由表3 可知,对照组(2-ME 溶液组)中药物主要分布在血液以及血流丰富的组织中,血浆中分布最多,其次为肺、肝、肾;而实验组(2-ME 纳米混悬剂组)药物在血浆中的分布明显减少,在肺、瘤及肝组织中的分布明显增加,说明2-ME 纳米混悬剂具有明显的被动靶向性。

图1 血浆和组织色谱图

表1 2-ME 在各生物样品中的标准曲线

2.3 靶向性评价 2-ME 纳米混悬剂和2-ME 溶液的TEC 和re 结果见表4。由表4 可知,2-ME 纳米混悬剂在肺、瘤组织中的总靶向效率明显提高,肝组织中的靶向效率略有提高,在其他组织中的靶向分布均有所减低,其中在血浆中的分布减低尤为显著。心、肝、脾、肺、脑、瘤组织的re 均大于1,瘤组织的re最大。

表2 2-ME 在各生物样品中的精密度及回收率(n=5)

表3 不同时间点2-ME 纳米混悬剂和2-ME 溶液在血浆和组织中的分布情况(n=5) μg/g

表4 2-ME 纳米混悬剂和2-ME溶液在血浆和组织中的TEC 和re

3 讨论

研究[10]表明,2-ME 与血浆蛋白的结合率较高。在2-ME 溶液中,药物成游离的分子状态,使得药物可迅速与血浆蛋白结合,结合型药物不能透过毛细血管向组织器官转运,药物大量滞留于血液中。而2-ME 纳米混悬剂呈亚微米胶态分散体系,在血浆中常会被巨噬细胞作为外来物而吞噬,巨噬细胞主要分布于肺、疏松结缔组织、肝、脾等处[11],因而降低了药物在血液中的浓度,更多地到达靶部位。有关2-ME 与肺细胞膜亲和性的研究[12]结果表明,肺泡表面存在与2-ME 特异性结合的受体,使得2-ME 纳米混悬剂具有较好的肺靶向性。肿瘤组织生长快速,血管形成较快,导致血管外膜细胞缺乏、基底膜变形,通透性增加,纳米粒有更多的机会蓄积在瘤体部位[13],因此具有较好的肿瘤靶向性。该研究结果显示,2-ME 纳米混悬剂在血浆中的分布明显减少,在肺、瘤及肝组织中分布明显增加,说明2-ME 纳米混悬剂具有明显的被动靶向性。此外,靶向性评价结果显示,心、肝、脾、肺、脑、瘤组织的re 均大于1,瘤组织的re 最大,说明2-ME 纳米混悬剂对心、肝、脾、肺、脑、瘤均具有靶向性,且对瘤组织的靶向性最好。

总之,2-ME 纳米混悬剂具有良好的肺肿瘤靶向性,使用2-ME 纳米混悬剂有望增强药物的治疗效果,提高治疗指数;该研究为肺肿瘤的靶向治疗提供了一定的实验依据。

[1]Bruce JY,Eickhoff J,Pili R,et al.A phase Ⅱstudy of 2-methoxyestradiol nanocrystal colloidal dispersion alone and in combination with sunitinib malate in patients with metastatic renal cell carcinoma progressing on sunitinib malate[J].Invest New Drugs,2012,30(2):794

[2]Harrison MR,Hahn NM,Pili R,et al.A phase Ⅱstudy of 2-methoxyestradiol (2ME2) NanoCrystal ® dispersion(NCD)in patients with taxane-refractory,metastatic castrate-resistant prostate cancer(CRPC)[J].Invest New Drugs,2011,29(6):1465

[3]Quezada M,Alvarez M,Peña OA,et al.Antiangiogenic,antimigratory and antiinflammatory effects of 2-methoxyestradiol in zebrafish larvae[J].Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol,2013,157(2):141

[4]胡海英,张丽娜,张正全,等.小鼠体内2-甲氧基雌二醇静脉乳剂的药动学及组织分布特征[J].郑州大学学报:医学版,2011,46(1):100

[5]Mueck AO,Seeger H.2-Methoxyestradiol:biology and mechanism of action[J].Steroids,2010,75(10):625

[6]王文佳,张正全,贾欣,等.2-甲氧基雌二醇对4T1、SPCA1 和PC-3 细胞的生长抑制作用[J].郑州大学学报:医学版,2012,47(6):804

[7]Du B,Li XT,Zhao Y,et al.Preparation and characterization of freeze-dried 2-methoxyestradiol nanoparticle powders[J].Pharmazie,2010,65(7):471

[8]Du B,Li Y,Li XT,et al.LC with fluorescence detection for the tissue pharmacokinetics of 2-methoxyestradiol solution and liposome after intravenous administrations to rats[J].Chromatographia,2009,70(7/8):1287

[9]徐淑云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社,2002.

[10]李杨,张青青,孙惠斌,等.2-甲氧基雌二醇大鼠血浆蛋白结合率的测定[J].中国新药与临床杂志,2011,30(10):755

[11]马伟峰,胡海英,连晓培,等.2-甲氧基雌二醇的大鼠在体胃肠吸收特性[J].郑州大学学报:医学版,2011,46(2):269

[12]Zhang QQ,Shi XF,Sun HB,et al.Preparation of lung cell membrane chromatography and the chromatographic affinity study of 2-methoxyestradiol and its derivatives[J].J Liq Chromatogr Relat Technol,2013,36(19):2669

[13]Fang J,Nakamura H,Maeda H.The EPR effect:unique features of tumor blood vessels for drug delivery,factors involved,and limitations and augmentation of the effect[J].Adv Drug Deliv Rev,2011,63(3):136

猜你喜欢
悬剂甲氧基雌二醇
丹皮酚混悬剂的制备
戊酸雌二醇治疗黄体酮胶囊配伍治疗不完全性药物流产的临床观察
陈皮中多甲氧基黄酮类成分的高效分离及其抑制SARS-CoV-2 3CLpro的潜在活性研究
木犀草素纳米混悬剂的制备与质量评价
1-[(2-甲氧基-4-乙氧基)-苯基]-3-(3-(4-氧香豆素基)苯基)硫脲的合成
波棱瓜子木脂素纳米混悬剂的制备
基于AuNP—AuNP—UCNP三联体结构的传感体系高效检测环境雌激素双酚A和雌二醇
DAD-HPLC法同时测定龙须藤总黄酮中5种多甲氧基黄酮
11个品种来源陈皮中多甲氧基黄酮的测定
绝经后雌二醇治疗对女性认知能力有益