河南汉族脑梗死患者血浆HCY水平及MS A2756G基因多态性检测*

李艾帆，张 华，范玉佳，燕 燕，李彦玲，赵幸娟，郑 红，许予明

1)郑州市第一人民医院神经内科 郑州450004 2)郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室 郑州450001 3)郑州市妇幼保健院 郑州450053 4)郑州大学第一附属医院神经内科 郑州450052

脑血管病具有高发病率、高复发率、高病死率及高致残率的特点，是全球范围内威胁中老年人健康的主要疾病之一，其中80%为缺血性卒中［1］。动脉粥样硬化是缺血性卒中一个重要的可控制的危险因素，除了传统的危险因素，如高血压、糖尿病、心脏病、高脂血症外，高同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)血症是近年来发现的新的卒中危险因素。许多研究［2-4］认为，高Hcy 血症和高脂血症在动脉粥样硬化的发生中起重要的作用。蛋氨酸合成酶(methionine synthase，MS)是Hcy 代谢途径中的关键酶之一，MS 基因2756A→G 突变(MS A2756G)在西方人群中比较常见，可导致血浆Hcy 水平的改变［5］，但国内的研究［6-7］存在争议。作者检测300例河南汉族脑梗死患者血浆Hcy 水平及MS A2756G 基因多态性，旨在进一步探讨血浆Hcy 水平及MS A2756G 基因多态性与河南汉族人群脑梗死的关系。

1 对象与方法

1．1 研究对象 选取2012年12月至2013年9月在郑州市第一人民医院神经内科住院的脑梗死患者300例，诊断标准参照WHO 修订的各类脑血管疾病诊断要点。大动脉粥样硬化性脑梗死96例，小动脉闭塞性脑梗死191例，心源性脑梗死5例，其他原因所致脑梗死3例，不明原因所致脑梗死5例。患者中男148例，女152例，年龄22～83(64．2 ±13．2)岁。对照组选择同期门诊健康体检者261例，其中男127例，女134例，年龄21～79(63．8 ±13．7)岁，均为无血缘关系的河南汉族人群，无脑卒中病史及家族史。以上两组均排除患癫痫、癌症、甲状腺功能异常、肝肾功能不全及胃部疾病伴巨幼红细胞贫血者。

1．2 血浆Hcy 水平测定 抽取空腹静脉血2 mL，采用循环酶法检测血浆Hcy 水平，＞15 mol/L 为高Hcy 血症。

1．3 PCR-RFLP 检测MS A2756G 基因多态性

1．3．1 基因组DNA 提取和引物设计 采集外周静脉血2 mL，EDTA 抗凝，采用酚-氯仿法提取人基因组DNA，无水乙醇沉淀后，加60 mL ddH2O 溶解。引物设计参照文献［3］。上游引物序列:5'-CATG GAAGAATATGAAGATATTAGAC-3';下游引物序列:5'-GAACTAGAAGACAGAAATTCTCTA-3'，PCR 扩 增产物大小为189 bp。

1．3．2 MS 基因特定片段的PCR 扩增 PCR 反应体系25 μL:STR Buffer(包含MgCl2、Dntp、10 ×Buffer)2．5 μL，上、下游引物各2．0 μL，Taq 酶0．4 μL，模板DNA 1．5 μL，ddH2O 补至25 μL。PCR 扩增条件:92℃预变性2 min;92℃60 min，56℃60 min，72℃90 min，35个循环;72℃延伸7 min。PCR 产物经20 g/L 琼脂糖凝胶电泳，EB 染色。

1．3．3 限制性内切酶酶切PCR 扩增产物 酶切反应体系20 μL，包括PCR 扩增产物10 μL，Hae Ⅲ0．5 μL，Buffer R 2．0 μL，ddH2O 7．5 μL。酶切产物在37℃水浴锅中温浴16 h。取6 μL 扩增产物加入20 g/L 琼脂糖凝胶负极端的加样孔，以溴酚蓝为指示剂，EB 为染色剂，在10 V 电压下电泳30 min，凝胶成像仪下观察并照相。

1．3．4 测序与鉴定 选取各基因型位点野生型、杂合突变型各30例、纯合突变型3例的PCR 产物，由上海宝生物有限公司进行测序分析。

1．4 统计学处理 采用SPSS 17．0 分析。两组年龄的比较采用两独立样本t 检验，性别和各疾病发病率以及MS A2756G 基因型和等位基因频率分布的比较采用χ2检验。不同基因型和不同脑梗死类型间血浆Hcy 水平的比较采用单因素方差分析。定量资料相关性采用线性相关分析，有等级资料的相关关系采用等级相关分析。血浆Hcy 水平、MS A2756G 基因型及其他危险因素与脑梗死的相关关系用logistic 回归分析，结果以相对危险度(odds ratio，OR)和95%可信区间(95%CI)表示。检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 两组一般资料比较 脑梗死组高血压及糖尿病的发病率均高于对照组，结果见表1。

表1 两组一般资料比较

2．2 两组及不同脑梗死类型血浆Hcy 水平比较脑梗死组血浆Hcy 水平为(19．3 ±7．2)μmol/L，高于对照组的(15．1±4．9)μmol/L(t =8．031，P＜0．001)。不同脑梗死类型患者血浆Hcy 水平比较见表2。

表2 不同脑梗死类型患者血浆Hcy 水平比较 μmol/L

2．3 PCR-RFLP 结果

2．3．1 酶切产物的判定结果 PCR 扩增产物经酶切后有3种基因型:野生型(AA 型)只有189 bp 片段;杂合突变型(AG 型)有159 和189 bp 片段;纯合突变型(GG 型)只有159 bp 片段。电泳结果见图1。

图1 酶切产物电泳结果

2．3．2 PCR 产物测序结果 见图2。

图2 PCR 产物测序结果

2．4 两组MS A2756G 基因型及等位基因频率分布比较 两组人群基因型分布均符合Hardy-weinberg 平衡(χ2=1．897，P=0．169)，具有人群代表性。脑梗死组和对照组间3种基因型和2种等位基因频率分布的比较见表3。

表3 两组MS A2756G 基因型和等位基因频率分布比较例(%)

2．5 MS A2756G 基因型与血浆Hcy 水平的关系474例MS A2756G AA 型、84例AG 型和3例GG 型受检者血浆Hcy水平分别为(17．31 ± 6．71)、(17．42 ±5．73)、(19．03 ±6．50)μmol/L，3 者比较差异无统计学意义(F=0．110，P=0．896)。

2．6 脑梗死危险因素分析 相关分析显示，血浆Hcy 水平与脑梗死的发生相关(r = 0．390，P＜0．001)，MS A2756G 基因多态性与血浆Hcy 水平无关(r =0．036，P =0．391)，与脑梗死的发生无关(r= －0．003，P =0．943)。以MS A2756G 多态性、Hcy 水平、高血压、糖尿病、高脂血症为自变量(MS A2756G 基因野生型为0，突变型为1;无高Hcy 血症为0，高Hcy 血症为1;无糖尿病为0，糖尿病为1;无高血压为0，高血压为1;无高脂血症为0，高脂血症为1)，以脑梗死是否发生作为因变量，采用logistic回归模型进行多因素分析，结果显示高血压、糖尿病、高脂血症、高Hcy 血症可以增加脑梗死的发病风险，MS A2756G 基因突变不增加脑梗死的风险。结果见表4。

表4 脑梗死危险因素的logistic 回归分析结果

3 讨论

Hcy 是一种含硫氨基酸，是机体内蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的一个重要中间产物。Hcy 在MS 催化下，以维生素B12 为辅酶，通过甲基化合成甲硫氨酸，通过再甲基化形成蛋氨酸。在Hcy 代谢过程中，甲硫氨酸合成酶的遗传缺陷以及叶酸、维生素B12 的缺乏均可使体内的甲硫氨酸代谢发生障碍，导致血浆Hcy 水平升高。近年来一些研究［2］已经证明血浆Hcy 水平升高与动脉粥样硬化性血管疾病，包括缺血性卒中有关。研究［8］认为高Hcy 血症与小动脉闭塞性卒中关系更密切;也有一些研究［9-10］认为高Hcy 血症与大动脉粥样硬化性卒中相关。这些研究结论仍有争议。该研究结果显示，脑梗死组的血浆Hcy 水平高于对照组，与Masser等［11］的研究结果一致。相关分析结果显示，血浆Hcy 水平与脑梗死的发生相关。Logistic 回归分析结果显示高血压、糖尿病、高脂血症、高Hcy 血症可以增加脑梗死的发病风险。以上结果提示在河南汉族人群中，高Hcy 血症是脑梗死的独立危险因素。

1996年Leclerc 等［5］首次在叶酸/维生素B12代谢障碍的cbⅠG 互补组患者中发现，甘氨酸取代了位于第919 位上的天冬氨酸;G 等位基因在加拿大白人中的分布较高，该位点突变影响了甲硫氨酸的甲基化过程，使体内的Hcy 水平降低，可以降低心血管事件的发生率。张广森等［12］研究发现，Hcy代谢相关酶G 等位基因频率在心脑血管组与正常对照组之间的差异无统计学意义。该研究结果显示，河南汉族人群中MS A2756G 基因型和等位基因频率分布差异无统计学意义。

MS A2756G 多态位点AA、AG、GG 3种基因型受检者的血浆Hcy 水平差异无统计学意义，提示MS A2756G 基因突变对血浆Hcy 水平无明显影响，与国内外文献［13-15］报道一致。Logistic 回归分析结果显示，MS A2756G 基因突变不是脑梗死的独立危险因素。由于MS A2756G 位点的突变率相对较低，要充分展示MS A2756G 位点多态性与脑梗死的关系，需要进一步扩大样本量，还需进行脑梗死的多个候选基因的联合分析。

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