短暂性脑缺血发作患者血栓前状态

帕丽丹·吾术尔 热依汉·尼沙 (新疆医科大学附属中医医院神经内科，新疆 乌鲁木齐 830000)

短暂性脑缺血发作(TIA)是公认的缺血性脑卒中最重要的独立危险因素，近期频繁发作的TIA是脑梗死的特级警报，4%～8%的完全性脑卒中发生于TIA之后，其形成机制复杂，多伴有血小板、凝血以及纤溶系统的异常〔1〕。血栓前状态(PTS)为一种凝血、抗凝及纤溶系统失调的病理过程，具有导致血栓形成的多种血液学变化。本研究对96例TIA患者PTS分子标志物进行检测，探讨PTS分子标志物在TIA患者中的变化及其意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2009年9月至2011年2月在新疆医科大学附属中医医院神经内科住院治疗的96例TIA患者，男52例，女44例，平均年龄(61.34±11.34)岁。诊断符合1995年第四届全国脑血管病会议修订的诊断标准〔2〕，并经头颅CT和(或)头颅磁共振成像(MRI)证实，排除了脑出血等其他脑血管疾患，发病前患者未曾服用过抗血小板聚集及抗凝药物，其中颈内动脉(ICA)系统TIA 35例，椎-基底动脉系统TIA 61例。健康对照组为我院健康查体者39例，男16例，女23例，平均年龄(59.42±10.65)岁，无高血压、糖尿病、心脏病等心脑血管疾病，且肝肾功能正常者。

1.2 血小板膜糖蛋白(CD62P)的检测 清晨采肘静脉血，全血由 EDTA 抗凝。各管加稀释液 70 μl，注入全血 5 μl，加入CD62P-FITC(法国 IMMUNOTECH公司)8 μl进行染色，轻摇混匀，避光孵育30 min，用PBS调整血小板浓度为1×106/μl，待测。打开流式细胞仪(EpicsXL-型流式细胞仪，美国Beckman Coulter公司)选择氩离子激光激发，激发浓度为488 nm，测定中以前向角散射(FSC)、对侧向散射(SSC)，调整电压，圈出血小板群，获取20 000个血小板黄光信号(FITC、PE)，用PMT2、PMT3收集，转化成log信号直方图，以Expo软件进行处理，得出CD62P的阳性血小板百分数。

1.3 凝血4项指标的检测 包括活化部分凝血活酶时间(PT)、纤维蛋白原(FIB)、凝血酶时间(TT)及血浆凝血酶原时间(APTT)。取清晨空腹静脉血2 μl，置于柠檬酸钠抗凝真空管，3 000 r/min，离心15 min，然后由血凝分析仪(AMAX-200型全自动血凝分析仪，德国Amelung公司)检测，使用FIB凝血酶、FIB定值血浆、FIB缓冲液等配套试剂(上海太阳生物技术有限公司)，采用CLAUSS比浊法。

1.4 组织性纤溶酶原激活物(t-PA)及其抑制物(PAI-1)的检测 采用酶联免疫吸附(ELISA)方法:采用96孔板的包被抗人t-PA抗体和PAI抗体的反应板(上海太阳生物技术有限公司)，将2 ml全血离心后取血浆;将待测血浆40 μl分别加入包被抗人t-PA抗体和PAI抗体的反应条内，充分混匀，37℃孵育150 min;洗板机(Sunrise Remote洗板机，丹麦Sunrise公司)洗涤;显色:每孔加OPD底物稀释液(上海太阳生物技术有限公司)100 μl，37℃孵育15～20 min;终止:每孔加终止液(上海西唐生物技术有限公司)50 μl;比色:在酶标仪(Sunrise Remote酶标仪，丹麦Sunrise公司)上492 nm处测定各孔的OD值。

1.5 内皮素(ET)的检测 取圆底聚苯乙烯试管若干，用微量加样器加样:血浆、125I-ET(红色)(北京北方生物技术研究所)、兔抗-ET抗血清(蓝色)(北京北方生物技术研究所)各100 μl，摇匀，4～8℃温育18～24 h。每管加入驴抗兔免疫分离剂(北京北方生物技术研究所)500 μl，充分摇匀，室温放置15 min，使用低速冷冻离心机(KDC-2046型低速冷冻离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司)3 500 r/min离心15 min，吸弃上清待测，使用放射免疫计数器(GC-2016γ型放射免疫计数器，科大创新股份有限公司中佳分公司)测各沉淀管的放射性计数(cpm)。数据处理:使用logit-log处理软件由电脑自动处理得出结果。

1.6 统计学处理 应用SPSS13.0软件进行t检验。

2 结果

与健康对照组相比，TIA组血小板表面CD62P的表达、血浆PAI-1水平均升高(P＜0.05);血浆 t-PA水平下降(P＜0.05)，见表1。与健康对照组相比，TIA组血浆FIB水平升高(P＜0.05);APTT缩短(P＜0.05);而 PT和 TT无差异(P＞0.05)，见表2。

表1 两组CD62P、t-PA、PAI-1测定结果(s)

表1 两组CD62P、t-PA、PAI-1测定结果(s)

与健康对照组比较:1)P＜0.05，下表同

组别 n CD62P(%)t-PA(ng/L)PAI-1(ng/L)TIA 组 96 4.45±2.811)15.25±10.101)52.63±14.161)健康对照组 39 2.29±1.58 22.33±7.39 47.49±12.80

表2 两组APTT、PT、TT及FIB结果(s)

表2 两组APTT、PT、TT及FIB结果(s)

组别 n APTT(s)PT(s)TT(s)FIB(mg/L)TIA 组 96 31.06±7.111)14.88±2.40 15.07±2.30 3.63±1.241)健康对照组 39 36.12±8.21 14.35±2.59 16.74±18.56 2.63±0.53

3 讨论

血栓前状态是指机体的促凝和天然抗凝机制平衡失调，血管内皮细胞、血小板、凝血、纤溶系统等发生改变所引起有利于血栓形成的病理状态〔3〕，其变化可以反映血管内皮细胞受损或受刺激;血小板和白细胞被激活或功能亢进;凝血蛋白含量增高或被激活;抗凝蛋白的含量减少或结构异常;纤溶因子含量减低或活性减弱;血液黏度增高和血流减慢等一系列病理变化。

CD62P是目前所知反映血小板活化与释放最特异的标志物〔4〕，其作用是介导血小板黏附于内皮细胞，以及血小板中性粒细胞与血小板单核细胞的连接，使中性粒细胞激活，释放多种活性酶、细胞因子等血管活性物质，损伤内皮细胞，引起基底膜通透性增加、细胞外基质增生、纤溶活性下降、纤维蛋白原沉积等多种生物学效应，启动血栓形成过程。本研究结果提示TIA患者本身即存在血小板活化的情况，并可能加速其血栓形成的进展，故检测血小板膜上CD62P，可以了解血小板活化程度，并可作为TIA患者病情监测的有效指标。

PT、FIB、TT、APTT是反映凝血功能状况的4个指标。其中PT是一种反映外源性凝血系统有无异常的较敏感筛选试验;TT是观察凝血因子血中抗凝物质增多与否;APTT是内源凝血系统较为敏感和常用的筛选试验;FIB是重要的凝血因子，是凝血系统中的“中心”蛋白质，是血浆中重要的凝血因子，可诱导血小板聚集，刺激因子相关抗原(vWF)释放，后者在调节血小板黏附于受损的血管壁过程中起关键作用。FIB同时是参与血小板黏集的重要辅助因子，在激活的血小板之间作为桥梁与血小板膜上的糖蛋白受体(GPⅡb/Ⅲa)结合，将它们互相连接起来，从而促进血小板黏集和血栓形成〔5〕。本研究提示TIA患者体内存在血液凝固性增强倾向。有报道FIB与局灶性脑血管病以及周围血栓性疾病的严重程度有很强的相关性〔6，7〕。血栓前状态时，PT、APTT可能缩短，FIB水平增高，故可以将 PT、APTT以及FIB作为血栓前状态的初步筛选指标〔8，9〕。因此，对于TIA患者，应常规检测PT、APTT以及FIB等凝血指标，以便充分了解血液的凝血状态以及判断血栓前状态的程度。

t-PA是纤溶系统的主要启动因子，它能选择性激活血栓中纤维蛋白原表面的纤溶酶原生成纤溶酶，水解纤维蛋白，是体内最强烈的纤溶酶原激活物。PAI-1的主要功能是以1∶1的比例与t-PA活性中心的丝氨酸发生不可逆的共价结合，形成复合物，这种复合物具有稳定性、不可逆性，从而抑制t-PA的活性〔10〕。t-PA过高和(或)PAI-1降低，致纤溶活性亢进，可以导致出血症状;t-PA过低和/或PAI-1增高，致纤溶活性降低，可以导致血栓形成。t-PA可清除正常血液循环中纤维蛋白，内皮释放的t-PA约95%被过量的PAI快速结合失去活性。t-PA降低，提示纤溶活力降低，是由血管内皮细胞功能紊乱所致。PAI升高主要是动脉粥样硬化引起血管内皮损伤导致t-PA合成能力降低，血管内膜下层平滑肌细胞增殖并向内膜移行合成PAI增多。所以，t-PA、PAI-1的检测临床常用于纤溶及纤溶抑制功能、内皮细胞功能以及血栓前状态的判断〔11〕。本文结果表明临床上采取抗凝治疗对于动脉硬化性斑块形成的低动力性TIA或深穿支性TIA以及栓塞性TIA是积极和有益的，因纤溶活性的降低，给予降纤酶治疗可能有助于提高纤溶活性，防止血栓的形成和进展，进而防止TIA的发生。

本研究提示早期和长期使用抗血小板及改善内皮功能的药物，可能对预防脑缺血性事件的发生和发展具有重要临床意义。另外，在临床处理TIA时，应兼顾抗血小板及抗凝治疗。

1 俞 龙，徐 耀，吴 健，等.短暂性脑缺血发作与血栓前体蛋白及纤维蛋白原的关系〔J〕.临床神经病学杂志，2005;18(6):411-3.

2 中华医学会神经科分会.各类脑血管疾病诊断要点〔J〕.中华神经科杂志，1996;29(6):379-81.

3 Bauer KA，Rosenberg RD.The pathophysiology of the prethrombotic state in humans:insights gained from stadies using markers of hemostatic system activation〔J〕.Blood，1987;70(2):343-6.

4 Haissan AS，Daniel Y，Jean F，et al.Endothelial progenitor cells bind and inhibit platelet function and thrombus formation〔J〕.Circulation，2009;120(22):2230-9.

5 Stephan P，Christoph G，Veronika S，et al.Plasma fibrinogen levels and porgonosis in patients with ovarian cancer:a multicenter study〔J〕.Oncologist，2009;14(10):979-85.

6 Lassila R，Peltonen S，Lepantalo M，et al.Severity of peripheral atherosclerosis is associated with fibrinogen and degradation of cross-linked fibrin〔J〕.Arterioscler Thromb，1993;13(12):1738-42.

7 Ferlito S，Condorelli M，Mazzone D，et al.Haemostatic balance in patients with acute focal cerebral vasculopathy〔J〕.Panminerva Med，1994;36(4):184-7.

8 王鸿利，宋善俊.分子标志物在诊断血栓前状态中的意义〔J〕.国外医学·输血与血液分册，1995;18(2):68-9.

9 邓家栋，杨崇礼，杨天楹，等.临床血液学〔M〕.上海:上海科学技术出版社，2001:1-113.

10 Kurt B，Jan-Hakan J，Torbjorn N，et al.Effects of carvedilol or metoprolol on PAI-1，tPA-mass concentration or von willebrand factor in chronic heart failure-a COMET substudy〔J〕.Thrombosis Res，2010;125(2):46-50.

11 With Noto AT，Bogeberg Mathiesen E，Amiral J，et al.Endothelial dysfunction and systemic inflammation in persons with echolucent carotid plaques〔J〕.Thromb Haemost，2006;96(1):53-9.