维吾尔族妇女子宫颈癌及宫颈上皮内瘤变组织中micRNA-21表达及与人乳头瘤病毒的关系

高冬梅 李小文 张媛媛 朱明玥 马斌林

(新疆医科大学附属肿瘤医院妇科，新疆 乌鲁木齐 830011)

人乳头瘤病毒(HPV)，特别是高危型病毒的感染在子宫颈鳞状细胞癌的发生过程中发挥着重要作用〔1〕。microRNA(miRNA)是一类单链非编码小分子RNA，在真核细胞中广泛分布，可通过与靶基因的信使RNA的3'UTR端碱基相对或完全配对，导致靶基因的翻译受到抑制，或者可以促进靶基因的降解，因此可以调控转录后的基因表达〔2〕。miRNA-21的编码基因定位于17q23.2，即液泡膜蛋白基因(VMP1)编码区，VMP1基因的第十内含子〔3〕。miRNA-21在人类多种肿瘤组织中表达上调，例如乳腺癌、胃癌、肺癌等〔4～6〕。17q23.2同样是HPV容易发生整合的区域〔7〕。HPV感染与女性宫颈癌的发生有密切联系，是否由于HPV的整合而导致miRNA-21在该肿瘤细胞中表达升高还有待于进一步研究。本研究分析miRNA-21与高危型HPV感染之间的关系，探讨其在子宫颈细胞恶性转变以及宫颈鳞状细胞癌(ICC)发生中的作用。

1 资料与方法

1.1 对象 收集新疆医科大学附属肿瘤医院病理科2009年6月至2013年12月维吾尔族妇女子宫颈鳞状细胞癌，宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ和Ⅱ级、CINⅢ级石蜡标本各20例，所有患者均未接受过放疗、化疗或者其他化学及物理治疗。患者年龄29～70岁，平均46.5岁。

1.2 试剂 HPV16型探针(Y1407)和通用型检测试剂盒(K0601)均来自美国Dako公司。TRIzol试剂购自Invitrogen公司，miRNA-21RT 引物、miRNA-21 Real time、U6 RT 引物、U6 Real time、2× PCR TaqMan Universal PCR ，TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒均购自ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 原位杂交法 3 μm厚石蜡组织切片脱蜡2次，无水乙醇2次，蛋白酶K消化。HPV16探针于载玻片上，加盖玻片，加热90℃ 5 min;42℃ 20 min，37℃过夜杂交;1×SSC和TBS2各冲洗3次;加检测试剂，孵育37℃ 20 min，TBS3冲洗3次;反应物孵育1 h水洗，核固红复染，脱水，封片观察。

1.3.2 实时荧光定量PCR检测miRNA-21 细胞总RNA采用Trizol一步法提取，RNA经异丙醇法浓缩，总RNA的纯度由分光光度计测定，总RNA的质量经甲醛变性凝胶电泳质检。根据试剂说明书操作，进行逆转录cDNA:反应条件:16℃ 30 min，42℃ 30min，85℃ 5 min。然后按 2×PCR TaqMan Universal PCR试剂盒说明书操作，应用U6 snRNA作为内对照。分别以miRNA-21和U6第一链为模板，用miRNA-21和U6 snRNA荧光探针为引物扩增以上荧光PCR。所有的检测均应用PRISM 7500型(Applied Biosystems，USA)荧光定量PCR仪进行测量，设立3个复孔，应用相对定量分析法2-△△CT进行结果分析。

1.4 统计学处理 运用SPSS19.0软件，计数资料比较采用χ2检验，计量资料组间比较用t检验。

2 结果

2.1 HPV16在ICC CIN I和Ⅱ，CINⅢ级组织中的表达差异ICC组织中HPV16阳性率为75%(15/20);CINⅢ级HPV16阳性率为55%(11/20);CINⅠ和Ⅱ级组织中 HPV16阳性率为20%(4/20)。CINⅠ和Ⅱ级与CINⅢ级、ICC组比较差异显著(P=0.024)，CINⅢ级与ICC组无显著性差异(P=0.160)。

2.2 miRNA-21在ICC，CINⅠ和Ⅱ、CINⅢ级组织中的表达差异 ICC组织中 miRNA-21表达(8.19±1.96)较 CINⅢ级(5.19±1.75)及CINⅠ和Ⅱ级(3.78±0.81)病变明显升高(P＜0.001)。CINⅠ和Ⅱ级、CINⅢ级组织中的miRNA-21表达也存在明显的统计学差异(P=0.007)。

2.3 不同宫颈病变中miRNA-21表达及HPV16表达之间的关系 miRNA-21在 HPV16阳性病变组织中的相对表达量为4.62±0.74，明显高于HPV16阴性病变组织中的表达(3.57±0.70)(P=0.014)。ICC和CIN I和Ⅱ级病变中，HPV16阳性病变组织中存在miRNA-21高表达的趋势，但是无统计学意义;CINⅢ级病变中，在HPV16阳性和阴性组织中miRNA-21表达存在明显的统计学差异。见表1。

表1 不同宫颈病变中HPV16阳性、阴性组miRNA-21表达比较(s)

表1 不同宫颈病变中HPV16阳性、阴性组miRNA-21表达比较(s)

与HPV16阳性比较:1)P＜0.05

HPV16 ICC CINⅢ CIN I和 Ⅱ阳性 8.69±1.98 6.04±1.81 4.62±0.74阴性 6.48±0.18 4.15±0.991) 3.57±0.70

3 讨论

microRNA是一类内源性非编码单链RNA，在转录后水平对基因表达起负调控作用，参与生物细胞的增殖、生长、发育、凋亡等重要生理及病理过程〔8～11〕。研究发现miRNA-21在肿瘤的发生发展过程中起着非常重要的作用，其表达量在各种肿瘤中均出现明显上升，与肿瘤细胞的转化、增殖、转移、血管生成和对治疗的抵抗等生物学行为都有关系〔3，5，9，12，13〕。目前关于miRNA-21在宫颈癌前病变及子宫颈癌病变中的研究还很有限。提示miRNA-21的表达失调可能在子宫颈上皮由癌前病变发展到子宫颈癌的过程中持续发挥作用。Yao等〔14〕应用实时定量PCR和原位杂交检测技术研究了宫颈鳞状细胞癌组织中和细胞株中miRNA-21的表达情况，研究结果显示宫颈鳞状细胞癌组织中和细胞株均存在miRNA-21的高表达，并且在宫颈鳞状细胞癌细胞株中miRNA-21表达上调可能与HPV16阳性有关。本研究结果显示miRNA-21在ICC癌前病变阶段及由癌前病变进展到ICC过程中随着病情发展其表达量呈现明显的上升，提示miRNA-21有可能成为新的检测宫颈癌的早期指标之一。已有研究报道血清标本中的miRNA-21可作为结肠癌诊断和预后标志物〔15〕。

细胞学实验研究显示了miRNA-21表达上调可能与HPV16阳性有关联。由于病例数有限，在ICC和CINⅠ和Ⅱ级组织中miRNA-21在HPV16阳性和阴性病变中表达虽然不存在统计学差异，但是都呈现了HPV16阳性病变中更高的表达。上述研究结果提示miRNA-21失调及表达量的增加可能与HPV阳性子宫颈癌前病变和ICC的发生有密切关系。

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