脑胶质瘤中miR⁃143对MACC1表达的调控作用

尚超，洪杨，郭艳，薛一雪

（中国医科大学1.基础医学院神经生物教研室，沈阳 110001；2.附属盛京医院神经外科，沈阳 110004；3.附属口腔医院中心实验室，沈阳110002）

脑胶质瘤是最常见的颅内肿瘤，约占中枢神经系统肿瘤的60%，具有恶性程度高、侵袭能力强等特性［1］。脑胶质瘤患者即使经手术及术后放化疗等治疗手段的积极干预，死亡率仍高达98%以上，2年生存率仅为20%。因此，加强对脑胶质瘤的病因学研究尤为迫切［2］。

本研究组的前期研究发现，MACC1基因在脑胶质瘤组织中表达明显上调，是脑胶质瘤潜在的癌基因［2］。但MACC1表达上调的原因尚不清楚。本研究拟应用实时定量PCR检测miR⁃143和MACC1基因在脑胶质瘤中的表达，并研究miR⁃143在脑胶质瘤中对MACC1表达的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象：37例脑胶质瘤及相应的癌旁组织均来源于2011年4月15日至2012年11月7日期间中国医科大学附属盛京医院神经外科住院患者。男22例，女15例，年龄45～62岁，中位年龄56.2岁。

人脑胶质瘤U87细胞系由中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库提供。

1.1.2 主要试剂：miRNA分离试剂盒及miRNA检测试剂盒 All⁃in⁃OneTMmiRNA qRT⁃PCR Detection Kit购自Genecopoeia公司。pre⁃miR⁃143、anti⁃miR⁃143及control miRNA购自Ambion公司。转染试剂Transmessenger购自Qiagen公司。引物由上海生工公司合成。抗MACC1抗体购自Abcam公司。West⁃ern blot相关试剂购自上海碧云天公司。荧光素酶活性检测系统Dual⁃Luciferase Reporter System购自Promega公司。野生型MACC1 3′非翻译区（3′un⁃translation region，3′UTR）荧光素酶载体 pGL3⁃MACC1 3′UTR⁃Wt（Wt.UTR）及突变型MACC1 3′UTR荧光素酶载体pGL3⁃MACC1 3′UTR⁃Mut（Mut.UTR）由Invitrogen公司提供。

1.2 方法

1.2.1 miR⁃143表达的检测：待测组织标本经液氮冷冻粉碎，应用mirVanaTMmiRNA isolation试剂盒提取总microRNA，应用All⁃in⁃OneTMmiRNA qRT⁃PCR Detection Kit对获取的microRNA的3′端进行加“Poly A”处理，然后将Poly A化的RNA进行反转录反应。以U6为内参基因，参照试剂盒说明书扩增miR⁃143基因。应用ABI公司的7500 Real⁃time PCR仪，7500 Software v2.0软件。采用比较CT值法（2-ΔΔCT法）对获得的数据进行相对定量分析。计算公式：（1）改变的倍数＝2-ΔΔCT；（2）ΔΔCT＝ΔCT肿瘤组-ΔCT癌旁组；（3）ΔCT＝CT靶基因-CT内参。

1.2.2 细胞转染：将U87细胞接种在6孔板中（5×104个/孔），培养24 h。1 mg的microRNA与试剂盒中的Enhanser R试剂混合，再与4 μL TransMessenger试剂混合，获得的混合物加入900 μL无血清培养基后用于孵育待转染的U87细胞，2 h后吸去培养基，PBS清洗2次，然后用正常培养基培养。

1.2.3 实验分组：以未转染的U87细胞为空白对照组（C1）；以转染control miRNA的U87细胞为阴性对照组（C2）；以转染pre⁃miR⁃143的U87细胞为pre⁃miR⁃143组（pre⁃miR⁃143）；以转染anti⁃miR⁃143的U87细胞为anti⁃miR⁃143组（anti⁃miR⁃143）。

1.2.4 Western blot：提取待测细胞蛋白，Bradford法进行定量。蛋白样品上样后，经SDS⁃PAGE电泳、转膜、封闭、抗体孵育、ECL发光和成像等步骤后获得图像结果。经GDS凝胶成像分析系统进行分析，MACC1的灰度值与内参蛋白GAPDH的灰度值的比值即为MACC1蛋白表达的相对值。

1.2.5 荧光素酶报告基因表达分析：将microRNAs及重组载体共转染脑胶质瘤U87细胞。分组如下：A组：pre⁃miR⁃143+Wt.UTR；B组：miR⁃143 control+Wt.UTR；C组：pre⁃miR⁃143+Mut.UTR；D组：miR⁃143 control+Mut.UTR。应用双荧光素酶检测系统（Dual⁃LueiferaseReporterSystem）检测转染后的细胞荧光素酶活性，步骤如下：弃培养液，PBS漂洗2次；加入1×PLB裂解液20 μL，常温振荡裂解15 min；加入LARⅡ溶液100 μL，双报告系统荧光素酶检测仪读取荧光值；加入Stop溶液100 μL，再次读取荧光值；计算相对荧光值。计算公式：相对荧光值=萤火虫荧光素酶荧光值/海肾荧光素酶荧光值。

1.3 统计学分析

每组实验重复3次。应用SPSS18.0统计软件对数据进行统计学处理。所有实验数据经正态性检验以明确资料的总体分布类型，正态分布数据用±s表示。样本呈正态分布且方差齐的多组间差异比较应用单因素方差分析，再用LSD⁃t检验做两两比较。2组独立样本均值比较采用t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 实时定量PCR检测脑胶质瘤组织中miR⁃143和MACC1的表达

通过引物溶解曲线分析，miR⁃143和MACC1基因均扩增成功。实时定量PCR结果经比较CT值法分析进行相对定量，miR⁃143在脑胶质瘤和癌旁组织中的ΔCT分别为6.043±0.427与5.216±0.418，ΔΔCT为0.827，脑胶质瘤组织中miR⁃143的表达明显下调，为癌旁组织中miR⁃143表达量的56.37%，差异有统计学意义（P＆lt;0.01）。

MACC1 mRNA在脑胶质瘤组织和癌旁组织中的ΔCT分别为 3.438±0.415与 4.834±0.463，ΔΔCT为-1.396，脑胶质瘤组织中MACC1 mRNA的表达明显上调，为癌旁组织中MACC1 mRNA表达量的263.17%，差异有统计学意义（P＆lt;0.01）。

2.2 miR⁃143和MACC1表达的相关性分析

对实时定量PCR获取的miR⁃143和MACC1表达的数据进行Pearson相关分析，2者表达的相关系数为-0.792，证实miR⁃143和MACC1的表达在脑胶质瘤中呈显著的负相关。

2.3 pre miR⁃143和 anti⁃miR⁃143对 U87细胞中MACC1蛋白表达的影响

Western blot结果显示：C1组、C2组、pre⁃miR⁃143组和anti⁃miR⁃143组均呈现清晰条带（图1）。4组细胞中MACC1蛋白的相对表达量分别为1.364±0.079、1.348±0.076、0.683±0.065和2.146±0.087。C1组和C2组之间无统计学差异；与对照组相比，pre⁃miR⁃143组中MACC1蛋白表达显著降低，而anti⁃miR⁃143组中MACC1蛋白表达显著增加，差异有统计学意义（P＆lt;0.05）。

图1 pre⁃miR⁃143和anti⁃miR⁃143对U 87细胞中M A C C 1蛋白表达的影响Fig.1 Influenceofpre⁃miR ⁃143 andanti⁃miR ⁃143 ontheexpressionofM A C C 1 proteininU 87 cells

2.4 荧光素酶报告基因表达分析

应用共转染技术将不同组合的pre⁃miR⁃143、miR⁃143 control、野生型表达载体Wt.UTR和突变型表达载体Mut.UTR转染到U87细胞中，结果表明共转染pre miR⁃143和Wt.UTR的报告基因活性相对于其他对照组明显降低，差异有统计学意义（P＆lt;0.05）（图2）。

图2 荧光素酶报告基因表达分析验证miR⁃143对M A C C 1基因的调控Fig.2 R egulatoryeffectofmiR⁃143 onM A C C 1 geneasverified byluciferasereportergeneexpressionanalysis

3 讨论

本研究组在前期研究中发现：脑胶质瘤组织中MACC1基因表达显著上调，而且应用RNA干扰技术沉默了U87细胞中MACC1基因后，结果显示MACC1基因沉默的U87细胞的增殖活力降低，凋亡率显著增强［2］。提示MACC1基因在脑胶质瘤中可能作为癌基因存在，但MACC1表达上调的原因尚不清楚。

microRNAs（miRNAs）是一类非编码的小分子RNA，长度为19～25个核苷酸。miRNAs主要通过与靶基因mRNA 3′UTR的完全或不完全配对，引起mRNA降解或翻译抑制，从而在转录后水平调控基因的表达［3］。miRNAs能够通过调节下游基因的表达和功能从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动［4，5］。我们应用 miRBase等生物信息学软件预测miR⁃143能够与MACC1基因的3′UTR结合。miR⁃143基因定位于5q32，在乳腺癌和肾癌等恶性肿瘤中呈现显著的表达降低［6～8］，而且能够通过靶向抑制CD44v3的表达进而抑制非小细胞肺癌的侵袭和转移［9］，在多种肿瘤中发挥肿瘤抑制基因的作用。据此我们推测，miR⁃143可能与MACC1基因存在调控关系，它在脑胶质瘤中的表达改变可能是MACC1基因表达上调的原因。

本研究中，实时定量PCR检测结果发现miR⁃143在脑胶质瘤组织中表达明显下调，相关性分析显示miR⁃143与MACC1基因的表达水平呈明显负相关。这与我们前期的预测相符。将pre⁃miR⁃143和anti⁃miR⁃143分别转染U87细胞，结果发现pre⁃miR⁃143和anti⁃miR⁃143能够分别下调和上调U87细胞中MACC1蛋白的表达。进一步证实了miR⁃143能够调控MACC1，抑制其表达，但MACC1是否为miR⁃143的靶基因，miR⁃143是否是通过直接与MACC1基因的3′UTR结合进而抑制其表达尚不清楚。荧光素酶报告基因检测分析明确了miR⁃143能够与MACC1基因3′UTR的结合，对MACC1基因的表达起负性调控作用。近期已有文献报道，miR⁃143能够在结直肠癌细胞中靶向负性调节MACC1基因的表达，其抑制效果及与MACC1基因的3′UTR的结合位点都与本研究结果相同，这证实了在多种肿瘤中miR⁃143对MACC1基因具有相同的调控作用［10］。

综上所述，本研究结果显示miR⁃143在脑胶质瘤中表达下调，且miR⁃143能够与MACC1基因的3′UTR结合，负性调控MACC1基因的表达，miR⁃143的表达下调是MACC1基因在脑胶质瘤中表达上调的原因之一。

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