MicroR NA⁃218⁃1⁃3p在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

栾岚，韩斌，王翠芳，白阳，滕猛，宦大为，徐洪涛，王恩华

（1.沈阳医学院附属中心医院病理科，沈阳 110023；2.中国医科大学附属盛京医院泌尿外科，沈阳 110004；3.中国医科大学附属第一医院病理科，沈阳 110001）

肺癌是全球范围内癌症死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌（non⁃small cell lung cancer，NSCLC）占80%～85%，尽管医疗水平已有长足的进展，可以通过手术、放化疗等治疗手段治疗NSCLC，其患者的预后生存率依然不尽人意。生命科学的不断发展使人们认识到新的肿瘤标记物和分子治疗靶点，其中在基因调控网络中起重要作用的miRNA引起了广泛的关注。miRNA是一类小分子非编码RNA，通过与靶基因3′UTR区结合降解或抑制其翻译。最新的研究表明miRNA的表达异常与肺癌关系密切［1，2］，作为miRNA的重要成员，miR⁃218家族参与多种生物学行为［3～5］，并在多种肿瘤中低表达［6，7］，而家族成员miR⁃218⁃1⁃3p的相关报道非常有限。本研究通过检测miR⁃218⁃1⁃3p在NSCLC组织和相应癌旁组织中的表达，探讨了miR⁃218⁃1⁃3p表达水平与临床病理特征的关系，为NSCLC的诊断和治疗提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

42例NSCLC和癌旁肺组织（癌旁组织距癌组织达3 cm以上）来自于沈阳医学院附属中心医院病理科2002⁃2008年搜集的病理标本，本研究所有患者术前均未接受任何放化疗治疗。患者临床病理资料包括性别、年龄、发病部位、组织学类型、组织学分级、淋巴结转移和病理分期均摘自患者病历资料。根据WHO标准由两位病理诊断医师确定病理诊断、组织学分级、临床病理分期、淋巴结转移。

1.2 RT⁃qPCR

按照操作说明使用Am1975 RecoverAllTM（Ambion）提取组织中的总RNA。按操作说明使用RT引物探针，在ABI 7900HT（Applied Biosystems，美国）中运行检测miR⁃218⁃1⁃3p（RiboBio，中国）的表达，RNU6B作为内参对照。通过3次独立实验使用公式RQ=2-ΔΔCt的方法进行数据分析。

1.3 统计学分析

使用SPSS 16.0软件用于统计学分析。实时定量结果数据经过lg2转换，使用平均值和标准差进行描述。配对t检验用于分析miR⁃218⁃1⁃3p在NSCLC和癌旁肺组织中的差异。Chi⁃square检验用于分析miR⁃218⁃1⁃3p的表达水平与临床病理因素的关系。

2 结果

2.1 miR⁃218⁃1⁃3p在NSCLC中的表达

实时定量方法检测miR⁃218⁃1⁃3p在42例NSCLC及配对癌旁中的表达情况，使用RNU6B作为内参对照，42例非小细胞肺癌中miR⁃218⁃1⁃3p表达低于癌旁组织者有33例，配对t检验检验结果显示非小细胞肺癌中miR⁃218⁃1⁃3p表达明显低于癌旁组织（P=0.011，图1，图2），差异有统计学意义。

2.2 miR⁃218⁃1⁃3p与临床病理因素的关系

为探讨miR⁃218⁃1⁃3p在NSCLC发生发展中所起的作用，按照miR⁃218⁃1⁃3p在42例NSCLC组织的中位表达水平分为高、低表达2组，采用Chi⁃square Test分析了miR⁃218⁃1⁃3p表达水平与42例NSCLC患者临床病理因素的关系。统计学分析显示，miR⁃218⁃1⁃3p的表达水平与淋巴结转移负相关（P=0.030，chi⁃square test，图3A），差异具有统计学意义。值得注意的是miR⁃218⁃1⁃3p的表达水平虽然与病理分期无统计学意义，但如图3B处于Ⅱ和Ⅲ的患者miR⁃218⁃1⁃3p的表达水平低于Ⅰ期患者，而其他临床病理因素如性别、年龄、发病部位、肿瘤体积、病理分型、分化等与miR⁃218⁃1⁃3p的表达水平均无相关性。

图1 miR⁃218⁃1⁃3p在42例NSCLC中的表达情况

图2 miR⁃218⁃1⁃3p在NSCLC组织与癌旁组织中的平均表达情况

图3 miR⁃218⁃1⁃3p与临床病理特征的关系

3 讨论

近年来，miRNA作为基因网络中重要的一环引起了越来越多的关注，miRNA有力的调节了基因表达并引起物种间序列的保守性为遗传的稳定性做出了极大的贡献。研究表明miRNA的表达具有组织特异性，并与肿瘤的发生发展密切相关。一些miRNA已被证明参与肺癌的发生和发展过程，并与肺癌的诊断，预后和治疗等相关，其中let⁃7在肺癌中低表达并与肺癌预后及临床病理因素相关，并通过抑制KRAS、HMGA2等癌基因发挥抑癌作用［8，9］。miR⁃205在鉴别肺癌亚型特别是鳞癌分型准确度很高［10］，miR⁃488，miR⁃503，miR⁃647被发现是与I期肺癌的复发有关［11］。

miR⁃218家族已被证明为多功能的miRNA，存在于多种组织中如肌肉、皮肤、脂肪等，其在骨骼形成，组织分化中发挥重要的作用［12～14］，在多种肿瘤中miR⁃218表现出促癌的潜质［15，16］。miR⁃218在染色体上的位置是肺癌中经常出现异常的片段，其中miR⁃218⁃1⁃3p和miR⁃218⁃1⁃5p位于4号染色体短臂上Slit2第15个内含子上，miR⁃218⁃2位于5号染色体长臂上Slit3的第14个内含子上［16］。miR⁃218⁃1⁃5p（miR⁃218）是影响NSCLC生存和无复发预后的独立因素，miR⁃218低表达且桩蛋白（PXN）阳性的患者预后不良，细胞中miR⁃218通过靶定PXN抑制细胞增殖、侵袭，甲基化特异性PCR（MSP）结果显示在肺癌细胞中存在启动子甲基化，细胞经过5⁃aza⁃dC的处理，miR⁃218和宿主基因Slit2恢复表达［4］。miR⁃218⁃1⁃3p与miR⁃218⁃1⁃5p共享同一个前体，在染色体上处于相同的位置，由此推断我们检测到的miR⁃218⁃1⁃3p在肺癌中的低表达很可能也是甲基化作用的结果。而经过统计学分析我们发现在42例NSCLC中miR⁃218⁃1⁃3p的表达水平与淋巴结转移相关，提示miR⁃218⁃1⁃3p可能在肿瘤转移中发挥作用。尽管miR⁃218的功能及在疾病中的作用逐渐被人所熟知，但miR⁃218⁃1⁃3p的相关文献还非常有限，我们的研究首次报道了miR⁃218⁃1⁃3p在NSCLC中的表达情况及和临床病理因素的关系，miR⁃218⁃1⁃3p如何在NSCLC中发挥作用的具体分子机制还需要进一步的深入研究，我们的报道为明确miR⁃218家族在肺癌中的作用提供了新的线索。

综上，miR⁃218⁃1⁃3p在42例NSCLC中低表达，并与淋巴结转移相关。鉴于miRNA通过调控靶基因调节细胞生物学行为，参与肿瘤的发生发展，NSCLC中miR⁃218⁃1⁃3p的功能和调控机制仍需进一步的研究。

［1］Yanaihara N，Caplen N，Bowman E，et al.Unique microrna molecu⁃lar profiles in lung cancer diagnosis and prognosis［J］.Cancer Cell，2006，9（3）：189-198.

［2］Johnson SM，Grosshans H，Shingara J，et al.RAS is regulated by the let⁃7 microrna family［J］.Cell，2005，120（5）：635-647.

［3］Yang L，Li Q，Wang Q，et al.Silencing of MiRNA⁃218 promotes mi⁃gration and invasion of breast cancer via slit2 ⁃robo1 pathway［J］.Biomed pharmacother，2012，66（7）：535-540.

［4］Wu DW，Cheng YW，Wang J，et al.Paxillin predicts survival and relapse in non⁃small cell lung cancer by microrna⁃218 targeting［J］.Cancer Res.2010，70（24）：10392-10401.

［5］Tie J，Pan Y，Zhao L，et al.MiR⁃218 inhibits invasion and metasta⁃sis of gastric cancer by targeting the robo1 receptor［J］.PLoS Gen⁃et，2010，6（3）：e1000879.

［6］Skalsky RL，Cullen BR.Reduced expression of brain⁃enriched mi⁃crornas in glioblastomas permits targeted regulation of a cell death gene［J］.PloS One，2011，6（9）：e24248.

［7］Ali S，Ahmad A，Aboukameel A，et al.Increased ras gtpase activity is regulated by mirnas that can be attenuated by cdf treatment in pancreatic cancer cell［J］.Cancer Lett，2012，319（2）：173-181.

［8］Takamizawa J，Konishi H，Yanagisawa K，et al.Reduced expression of the let⁃7 micrornas in human lung cancers in association with shortened postoperative survival［J］.Cancer Res，2004，64（11）：3753-3756.

［9］Ma L，Li GZ，Wu ZS，et al.Prognostic significance of let⁃7b expres⁃sion in breast cancer and correlation to its target gene of bsg expres⁃sion［J］.Med Oncol，2014，31（1）：773.

［10］Lebanony D，Benjamin H，Gilad S，et al.Diagnostic assay based on hsa⁃mir⁃205 expression distinguishes squamous from nonsquamous non⁃small⁃cell lung carcinoma［J］.J Clin Oncol，2009，27（12）：2030-2037.

［11］Patnaik SK，Kannisto E，Knudsen S，et al.Evaluation of microrna expression profiles that may predict recurrence of localized stage i non⁃small cell lung cancer after surgical resection［J］.Cancer Res，2010，70（1）：36-45.

［12］Botchkareva NY.MicroRNA/mRNA regulatory networks in the con⁃trol of skin development and regeneration［J］.Cell Cycle，2012，11（3）：468-474.

［13］Gu J，Xuan Z.Inferring the perturbed microrna regulatory networks in cancer using hierarchical gene co⁃expression signatures［J］.PloS One，2013，8（11）：e81032.

［14］Bengestrate L，Virtue S，Campbell M，et al.Genome⁃wide profiling of micrornas in adipose mesenchymal stem cell differentiation and mouse models of obesity［J］.PLoS One，6（6）：e21305.

［15］Schmid BC，Rezniczek GA，Fabjani G，et al.The neuronal guid⁃ance cue slit2 induces targeted migration and may play a role in brain metastasis of breast cancer cells［J］.Breast Cancer Res Treat，2007，106（3）：333-342.

［16］Yang M，Liu R，Sheng J，et al.Differential expression profiles of mi⁃crornas as potential biomarkers for the early diagnosis of esopha⁃geal squamous cell carcinoma［J］.Oncol Rep，2013，29（1）：169-176.