抗VEGF抗体对人胆管癌移植瘤裸鼠模型的治疗作用观察

冯 亮，李志钰

(哈尔滨医科大学附属第二医院，哈尔滨150001)

胆管癌临床症状出现较晚，早期诊断困难，容易向周围组织浸润、转移，外科手术切除率低，且对放化疗不敏感，预后较差，3 年生存率 ＜11%［1，2］。深入研究胆管癌的发病机制并寻求新的治疗途径是目前研究热点。Bevacizumab是针对VEGF的单克隆抗体，可通过阻断VEGF与受体的结合而抑制肿瘤组织血管生成，对肺癌、乳腺癌和结直肠癌血管生成有一定作用［3］，对肝癌细胞株也有一定的抑制作用，但其对胆管癌能否发挥抗血管生成作用目前鲜见报道。2012年1～12月，我们观察了Bevacizumab单克隆抗体对裸鼠胆管癌血管生成的抑制作用，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 55只BALB/c-nu裸小鼠，5～6周龄，体质量18～22 g;SPF环境下饲养。人胆管癌细胞株QBC939细胞株购自上海复祥生物科技有限公司;Bevacizumab(商品名 Avastin)为 Genentech Inc产品;兔抗人VEGF抗体、兔抗人CD34抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 胆管癌移植瘤模型制作及干预 将QBC939细胞株(1×106个)接种于小鼠右腋窝皮下。接种后观察肿瘤生长情况，肿瘤直径约0.5 cm(游标卡尺测量)时即用于实验。将动物随机分为对照组15只，药物1组及药物2组各20只。对照组腹腔注射生理盐水0.2 mL/次，药物1组及药物2组分别腹腔注射Bevacizumab 5、10 mg/kg;均每周2次，连续给药4周。

1.3 观察项目

1.3.1 肿瘤体积 治疗前及每次治疗时测量肿瘤体积(=1/2×长径×短径2)，共8次。

1.3.2 肿瘤组织VEGF表达 治疗结束后1周处死小鼠取移植瘤组织，常规步骤制作石蜡包埋标本，连续4 mm切片，采用免疫组化SP法检测VEGF表达。胞质棕黄色着色为阳性细胞。阳性细胞数25%以下为阴性(-);25%～50%为弱阳性(+);50%～75%为阳性(++);75%以上为强阳性(+++)。(-)与(+)为低表达，(++)与(+++)为高表达。

1.3.3 肿瘤微血管密度(MVD) 参考Weidner改进方法［4］，以 CD34阳性血管数作为微血管密度(MVD)，先于低倍镜下(50×)确定热点处，再于高倍镜下(200×)任选不重复的5个视野，计数阳性血管数，取平均数为MVD。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件行统计学处理。计量资料采用±s表示，治疗前后比较采用方差分析，治疗后组间比较采用方差分析;计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结果

药物2组用药3周后小鼠死亡2只，药物1组及对照组无死亡。

2.1 肿瘤体积 用药后各观察点药物1组及药物2组肿瘤体积，但两组无统计学差异。但均明显小于对照组(P均＜0.05);三组肿瘤体积变化趋势见图1。

图1 各组用药第1～4周移植瘤体积变化

2.2 VEGF表达水平 药物2组、药物1组、对照组 VEGF 阳性率分别为 53.5%、56.6%、68.5%，三组间比较无统计学意义;药物2组、药物1组、对照组VEGF高表达率分别为72%、75%、80%，药物2组、药物1组均低于对照组，P＜0.05。

2.3 MVD 药物2组及药物1组MVD分别为23.50 ± 3.23和 23.50 ± 3.23，对照组为55.86 ±4.73;药物2组及药物1组均低于对照组(P＜0.05)，但药物2组及药物1组比较无显著差异。

3 讨论

近年来针对肿瘤相关因子的靶向治疗成为肿瘤防治的重要策略。由于血管生成对于肿瘤生长和转移具有重要作用，使得抗血管生成治疗成为一个独立性策略［5］。

血管生成是一个由已存在的血管内皮增殖、迁移，生长出新毛细血管的过程。肿瘤血管生成是由包括肿瘤细胞、内皮细胞、细胞外基质等构成的肿瘤微环境的共同作用，在特定作用下刺激毛细血管内皮细胞的增殖;其中VEGF信号通路起关键作用。研究发现多种肿瘤细胞以及巨噬细胞可以分泌VEGF［6，7］，VEGF 与血管内皮上的受体(VEGFR)结合，激活受体自身磷酸化并启动一系列下游信号活动，促进内皮细胞增殖、侵袭和迁移，导致新生血管形成，并改变血管通透性［8，9］，而大量新生血管形成是直径＞2 mm的肿瘤继续生长必不可少的条件;抑制VEGF诱导的血管生成信号理论上可阻断合成血管的必要成分并改变其通透性［5，10，11］。有报道，40%～60%的胆管癌病例癌组织VEGF呈高表达，说明VEGF过度表达可促进肿瘤发展;有研究认为胆管癌组织VEGF的表达强度与胆管癌的病理分期、淋巴结转移等有相关性，VEGF表达越强，患者的预后越差［12，13］;故理论上针对VEGF的治疗也能起到抑制血管生成的作用。

Bevacizumab为重组人单克隆抗体，是第一个在固体肿瘤中显示出有效性的抗血管生成药物，FDA已批准其用于结直肠癌、肺癌、乳腺癌等的治疗，特别是对于晚期肿瘤患者能延长生存期、提高生存质量［14，15］。本研究结果显示，与对照组比较，两药物组肿瘤体积增长较缓慢，说明Bevacizumab可抑制肿瘤生长;两药物组肿瘤中心以及周边区域MVD均明显少于对照组，说明Bevacizumab具有抑制血管生成的作用，与此前相关报道一致［16～18］。Bevacizumab的作用机制为能够结合细胞外VEGF并阻止其与内皮细胞上受体 (Flt-1及 KDR)结合，进而抑制血管生成［19］。由于Bevacizumab为针对VEGF的单克隆抗体，也验证了在胆管癌中VEGF异常表达所导致的促进肿瘤生长作用，同时证实了采用抗VEGF抗体阻断血管生成治疗对于控制胆管癌进展的有效性。有报道认为Bevacizumab具有抑制肿瘤细胞VEGF表达，并促进肿瘤细胞凋亡的作用［20］，本研究两药物组肿瘤组织VEGF表达阳性率较对照组降低，但并不显著，说明Bevacizumab对胆管癌的抑瘤作用主要取决于其对血管生成的抑制作用。

一般认为人类对Bevacizumab的耐受性较好，推荐剂量不会出现不良反应。本研究药物1组未出现明显的药物毒性反应，但药物2组出现小鼠死亡的现象，考虑为裸小鼠的耐受量比人低。提示应用Bevacizumab时应参考推荐剂量。

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