高表达重组人组织激肽释放酶7基因的前列腺癌单克隆细胞株的构建

林志弟，莫林键，张成东，宣 强，张悦宁，莫曾南，滕若冰，杨小丽，

(1广西医科大学第一附属医院;2广西医科大学医学科学实验中心)

前列腺癌是成年男性最常见的恶性肿瘤之一，在美国其发病率居男性恶性肿瘤首位，在我国其发病率逐年上升。重组人组织激肽释放酶7基因(Kallikrein 7，KLK7)是人类组织激肽释放酶基因家族的成员之一，编码hK7蛋白。研究显示该家族成员在多种恶性肿瘤组织中表达上升，可能为某些肿瘤的分子标记物［1］。本课题组前期研究发现，该基因在晚期前列腺癌组织中表达下降［2］。2012年3～9月，我们构建了高表达KLK7的前列腺癌稳定细胞株，旨在为KLK7在前列腺癌发生发展中作用的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 菌种、细胞、质粒 TOP10感受态菌及pcDNA3.1克隆表达载体购自美国Invitrogen公司;人类前列腺癌细胞系DU145购自中国科学院生物细胞所细胞库。构建重组载体所需反转录试剂盒、DNA聚合酶与限制性内切酶KpnⅠ购自TaKaRa公司;LipofectamineTM2000、Trizol Reagent及 SOC 培养基为美国Invitrogen公司产品;蛋白分子量Marker由赛百胜公司提供;PCR相关试剂为上海生物工程有限公司产品;细胞培养试剂购自Gibco公司;抗体购自Abcam公司。

1.2 人KLK7完整开放读码框(ORF)扩增 分离纯化人正常前列腺组织上皮细胞，Trizol法提取总RNA，-80℃保存备用。反转录合成 cDNA，行PCR扩增。为提高蛋白的表达效率，引物中设计引入KOZAK系列。上游引物:5'-ACCATGGCAAGATC CCTTCTCC-3';下游引物:5'-TTAGCGATGCTTTTTCA TGGTGTC-3'。PCR 反应条件:95 ℃ 、5 min，1个循环;95 ℃、1 min，56 ℃、1 min，72 ℃ 、1 min，30个循环;最后72℃延伸10 min。扩增产物全长765 bp。产物于1.7% 琼脂糖胶电泳，凝胶成像系统检测。

1.3 真核表达载体构建 选择真核 pcDNA3.1表达载体。将PCR产物电泳后切胶纯化，T4 DNA连接酶将产物与pcDNA3.1表达载体进行连接。连接产物转化至感受态大肠杆菌TOP10。应用Amp抗性的LB琼脂平板培养基筛选阳性克隆，挑取白色菌落扩增培养，提取质粒。对重组质粒进行酶切鉴定，之后进行DNA测序。将测序得到的序列与NCBI公布的KLK7全长cDNA序列进行比对。

1.4 细胞转染 将DU145细胞置于内含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的RPMI 1640培养液中，于饱和湿度、5%CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞按2×105个/孔密度种于24孔板中，过夜培养使得次日细胞汇合度达到90%～95%，按阳离子脂质体载体(LipofectamineTM2000)操作说明进行转染。24 h后弃去旧培养液，消化细胞接种于10 cm培养皿进行培养，700 μg/mL G418进行细胞筛选。设置空载体细胞作为对照。筛选出单克隆细胞后行扩大培养。

1.5 转染细胞株KLK7表达测定 采用Western blot法。分别提取空载体转染细胞和pcDNA3.1-KLK7转染细胞的蛋白，定量，行聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白分离后电转到PVDF膜;5%脱脂奶粉的TBS室温封闭1 h，一抗(1∶1 000)4℃摇床孵育过夜;TBS洗膜后二抗(1∶3 000)室温1 h;再次洗膜，化学发光，显影，定影。

2 结果

2.1 pcDNA 3.1-KLK7载体结构 载体酶切鉴定抽提质粒，采用KpnI限制性内切酶进行酶切，载体结构如图1。因 pcDNA3.1载体和KLK7开放读码框上各有一个酶切位点，该酶在插入方向正确的重组表达载体电泳显示切下的条带为686 bp，与预期相符，见图2。对符合预期的重装质粒DNA测序验证，结果见图3。

图1 pcDNA3.1-KLK7结构及酶切位点位置示意图

图2 载体KpnⅠ限制性内切酶酶切电泳图

图3 阳性质粒DNA测序图(部分)

2.2 转染细胞株KLK7表达 蛋白免疫印迹结果表明，空载体组细胞无目的条带，而转染细胞有特异条带，大小与文献报道相符。说明转染的DU145成功表达hK7蛋白;而对照细胞不表达hK7。见图4。

图4 转染细胞及空载体细胞hK7表达比较

3 讨论

KLK7编码hK7蛋白;该家族分子结构保守，均表达丝氨酸蛋白酶活性;目前共发现有15个成员，按发现先后记为KLK1～KLK15，相应所编码的蛋白为hK1～hK15［3］。hK7最早被发现在皮肤角质层高表达，因其具有糜蛋白酶样活性，最先被命名为角质层糜蛋白酶(SCCE);hK7参与表皮脱屑相关的各种生理和病理过程，主要机制是降解角质层细胞间的桥粒等胞间连接结构从而造成细胞脱落。研究显示这是一个有丝氨酸蛋白酶参与的蛋白水解过程［4，5］。

人体很多体液中有较高hK7表达，如卵巢癌腹水、乳汁、唾液、精液、血清、滑膜液、男性尿液等［1］。近年的一些研究结果显示hK7与某些恶性肿瘤的发生发展有相关性，如 hK7 在卵巢癌［6］、胰腺癌［7］、结肠癌组织中表达上调［8］，而hK7在乳腺癌及前列腺癌组织中表达下调［9］;这些肿瘤有激素依赖性的，也有非激素依赖性的(多数KLKs表达受激素调控)。hK7已经被认为是卵巢癌及宫颈癌的潜在标志物［10，11］。在脑肿瘤中，hK7 也与脑瘤细胞的恶性程度成正相关［12］。关于hK7在肿瘤中如何发挥作用，有研究认为hK7可通过降解胞外基质，导致上皮细胞脱落及细胞结构松散，从而促进肿瘤细胞浸润及转移［10，13］。其他的体外研究发现，hK7剪切E-钙黏素分子产生的可溶性片段可以促进胰腺肿瘤的转移［14］。目前关于hK7在肿瘤发生发展中的确切作用模式尚不明确，较多学者认为其与恶性病变相关。

本课题组前期的研究显示，前列腺癌组织中KLK7表达较癌旁及前列腺增生细胞低，其作用机制尚不清楚［15］。为深入研究其功能，包括其参与的信号通路、对细胞的影响等，需要构建高表达hK7蛋白的前列腺癌细胞株。本研究成功构建了KLK7的真核表达载体，并获得一系列表达量不同的稳定细胞株，从中筛选出高表达株有助于进一步的研究。

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