TK基因治疗库欣病的实验研究

宋庆鑫，王建鹏，阴晓峰，相恒伟，刘 霞，张 欣，孙 鹏

(1青岛大学医学院临床系，山东青岛266071;2青岛大学医学院附属医院黄岛分院)

库欣病是由于垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)腺瘤或ACTH细胞增生，使垂体分泌过量ACTH引起肾上腺皮质增生、皮质醇增多症、物质代谢紊乱和一系列病理变化。当肿瘤＜1 cm时可通过手术切除，治愈率为75%～80%［1］;肿瘤较大时治愈率则低于50%［2］。药物治疗和放射治疗为库欣病的辅助疗法，但治疗效果不明显［3，4］。随着分子生物学的发展，很多遗传疾病和肿瘤已经尝试行基因治疗，采用腺病毒载体转染有毒基因进入目的细胞，可达到杀死肿瘤细胞的目的［5、6］。基因的靶向性表达是基因治疗的一个重要因素，要求腺病毒转染的基因必须高水平表达且能选择性的在特定细胞中表达。2013年9月～2013年11月，我们观察了阿黑皮素原(POMC)启动子调控的单纯孢疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因(以下简称TK基因)在小鼠AtT20细胞中的靶向性表达，现分析结果，探讨其用于库欣病治疗的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠垂体瘤细胞 AtT-20/D16v-F2(以下简称AtT20)购自上海浩然生物技术有限公司;人乳腺癌细胞T47D购自上海艾研生物科技有限公司;腺病毒载体AdPOMCTK购自北京诺赛基因组研究中心公司;非放射性细胞增殖检测试剂盒购自武汉天源生物技术有限公司。核苷类似物更昔洛韦(GCV)购自湖北科益药业股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 小鼠AtT20细胞于含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基中培育，T47D细胞于在含有10%FBS的RPMI培养基中培育;培养基中均含有浓度为100 U/mL的青霉素及链霉素。所有培养基均置于37℃、5%CO2培养箱中，待细胞增殖至对数生长期时用于研究。

1.2.2 细胞转染及TK基因表达检测 将对数生长期AtT20细胞和T47D细胞按2×105/mL的密度分别接种于12孔板。培养24 h后，分别采用感染复数(MOI)为10 PFU/cell的AdPOMCTK转染细胞(转染组)，空白组替换成等量PBS溶液。转染48 h后，用PBS冲洗细胞2次，再将细胞置于0.3 mL的缓冲液中。将样品在干冰乙醇浴中冷却后置于37℃水浴，重复3次。裂解细胞，将裂解液置于离心管中，4℃离心20 min，上清液置于-70℃保存。提取蛋白，用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺(SDSPAGE)凝胶电泳后将蛋白质电转到硝酸纤维素膜上;用含5%脱脂奶粉的TBST常温密闭2 h后，加入一抗:兔源多克隆HSV-TK抗体(1∶800)，4℃孵育过夜，TBST缓冲液漂洗10 min×3次后加入二抗:HRP标记的goat anti-rabbit IgG，常温1 h;TBST缓冲液漂洗10 min×3次;显色，压片，显影，定影;观察TK基因表达。

1.2.3 细胞转染后对GCV的敏感性检测 将对数生长期AtT20细胞和T47D细胞以5×103/mL的密度接种于 96 孔板中 ，分别采用 MOI为 0、0.5、1、5、10、100 PFU/cell的AdPOMCTK转染;转染1 h后，以分别加入0、0.5、2.5和5 mg/mL浓度的 GCV 和新鲜培养基，每2天添加1次，第4天应用非放射性细胞增殖检测试剂盒测定转染后AtT20细胞对GCV的敏感性，即细胞存活率。实验重复3次。细胞存活率=GCV干预细胞的吸光度/GCV未干预细胞的吸光度×100%。

1.2.4 旁观者效应观察 将转染与未转染 Ad-POMCTK 的 AtT20 细胞分别以 1∶4、2∶3、3∶2 和 4∶1的比例混合，以4×103个/mL的密度接种于96孔板中。培养1 d后，实验组加入浓度为10 μg/mL的GCV，对照组加入等量PBS溶液，每隔2天添液1次。4 d后检测细胞存活率。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0软件行统计学分析。不同更昔洛韦浓度及MOI转染浓度间细胞存活率差异的比较采用析因设计的方差分析法，不同转染方式间细胞存活率的差异比较采用成组设计的方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞转染后TK基因表达 转染后48 h，AtT20细胞有明显的蛋白条带，分子量为46 K。T47D细胞无明显蛋白条带，空白组完全没有目的基因表达。说明TK基因已转染入AtT20细胞，并成功表达。见图1。

图1 AtT20细胞转染后TK基因表达

2.2 细胞转染后对GCV的敏感性 ①AtT20细胞:细胞存活率随MOI的升高而降低(F=448110.467，P＜0.001);随 GCV浓度升高而降低(F=360780.586，P ＜0.001);GCV 浓度与 MOI浓度间存在显著的交互效应(F=28574.837，P ＜0.001)。在各MOI浓度时，细胞存活率均随GCV浓度增加而降低。当GCV浓度为0 mg/L时，除0.5与1的MOI浓度间差异不显著外，其它两两比较均有显著差异;当GCV浓度为0.5～5 mg/L时，细胞存活率均随MOI浓度增加而降低。见表1。②T47D细胞:细胞存活率随GCV 浓度升高而降低 (F=3.243，P=0.027);随MOI浓度升高而降低(F=1874.888，P ＜0.001);GCV 浓度与MOI浓度间的交互作用不显著(F=0.293，P=0.995)。见表2。

表1 不同GCV浓度及MOI浓度作用后AtT20 细胞存活率比较(n=4， ±s)

表1 不同GCV浓度及MOI浓度作用后AtT20 细胞存活率比较(n=4， ±s)

GCV0 mg/L GCV0.5 mg/L GCV2.5 mg/L GCV5 mg/L 0 99.00 ±0.37 99.65 ±0.24 94.95 ±0.13 91.95 ±0.MOI(PUF/cell)细胞存活率(%)24 0.5 99.60 ±0.18 69.03 ±0.13 53.05 ±0.13 40.00 ±0.18 1 99.50 ±0.22 44.33 ±0.13 35.90 ±0.14 29.18 ±0.13 5 98.55 ±0.17 26.33 ±0.17 18.83 ±0.15 17.03 ±0.13 10 98.08 ±0.13 23.20 ±0.14 16.05 ±0.13 7.55 ±0.21 100 34.23 ±0.21 11.28 ±0.13 7.68 ±0.22 4.98 ±0.28

表2 不同GCV浓度及MOI浓度作用后T47D 细胞存活率比较(n=4，±s)

表2 不同GCV浓度及MOI浓度作用后T47D 细胞存活率比较(n=4，±s)

GCV0 mg/L GCV0.5 mg/L GCV2.5 mg/L GCV5 mg/L 0 98.60 ±0.75 98.95 ±0.97 98.38 ±0.83 98.20 ±0.MOI(PUF/cell)细胞存活率(%)88 0.5 98.88 ±0.83 98.05 ±1.10 98.13 ±0.91 98.03 ±0.97 1 98.83 ±0.79 98.40 ±0.42 97.80 ±1.12 97.80 ±0.77 5 98.38 ±0.69 98.03 ±0.86 97.98 ±0.88 97.85 ±0.47 10 98.00 ±0.51 98.23 ±0.71 97.90 ±0.68 97.50 ±0.71 100 77.25 ±1.05 76.78 ±0.41 76.58 ±0.72 76.55 ±0.79

3 讨论

在激素分泌性垂体腺瘤中库欣病占5%～10%，由于垂体分泌过量ACTH，引起肾上腺皮质增生，产生皮质醇增多，引起下丘脑—垂体—肾上腺轴机能紊乱，导致一系列物质代谢紊乱和病理变化。库欣病是一种耗竭性疾病，很少能自行缓解，若不及时诊治，死亡率较高。经鼻—蝶窦垂体手术为治疗库欣病的有效方法［7］，但多数患者仍难以治愈。

近年来基因治疗成为肿瘤治疗的新策略。基因治疗的最大问题是基因的特异性表达，毒性基因在特定细胞中表达成为一个重要的突破点。研究表明POMC启动子可以在AtT20细胞中很好的表达。本研究证实带POMC启动子的腺病毒载体能转染入AtT20细胞中并成功表达，在T47D细胞中却不能明显表达，说明腺病毒载体的转染具有靶向性。毒性基因通常选用HSV-TK基因，应用人工合成的核苷类似物GCV激活TK基因，从而产生细胞毒性作用。肿瘤细胞内TK基因表达的胸苷激酶可催化GCV形成单磷酸化产物，并在细胞内磷酸激酶的作用下形成三磷酸 GCV，后者可阻碍 DNA 合成［9，10］。通过调节GCV剂量来激活毒性基因的方法为垂体腺瘤的治疗提供了一个崭新的视角和可行的方案。TK基因在肿瘤治疗方面具有明显优势，其诱导形成的三磷酸GCV仅对分裂期细胞产生毒性，而对低有丝分裂指数的正常细胞无毒性作用，即其杀伤作用仅局限于肿瘤细胞［11］。此为其治疗肿瘤提供了可靠的理论依据［12］。

TK基因作为毒性基因的另一好处是其具有旁观者效应［13］。这种效应反映了HSV-TK诱导的三磷酸GCV可通过细胞间隙连接细胞与细胞之间的联系，从而杀死相邻的细胞。本研究发现当肿瘤细胞中只有20%表达TK基因就产生对GCV明显的敏感性;而感染相同数量的AdPOMCTK细胞经GCV治疗后可引起95%以上的细胞死亡，证实TK基因治疗库欣病具有良好的效果。

本研究结果显示，AdPOMCTK可在AtT20细胞中有效表达有毒基因，且具有靶向性。AdPOMCTK及其类似的病毒载体有望用于库欣病的基因治疗。目前需解决的问题是需进一步确定重组腺病毒的有效性和安全性。

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