PEG化重组尿酸氧化酶蛋白含量测定方法研究

李晶，苑方园，程速远，张慧，梁成罡

1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；2.昆明理工大学，云南 昆明 650504

尿酸氧化酶（urate oxidase，UOX）是生物体内嘌呤代谢途径中的关键酶之一，能将难以溶解的尿酸氧化为尿囊素、过氧化氢和二氧化碳[1-2]，尿囊素的溶解度是尿酸的5～10 倍，易于排出体外，从而缓解痛风病人的痛苦。UOX 由4 个相同的亚基组成，每个亚基由302 个氨基酸残基构成，整个蛋白的相对分子质量约为145 000～150 000，分子较大[3]。UOX 广泛存在于细菌、真菌、植物、鸟类、爬行类动物体内，但在人类及某些灵长类动物（如狒狒和猿）的进化过程中，其第33和187 位的2 个氨基酸残基发生了无义突变，导致编码提前终止，使人类不能产生有生物活性的UOX[4-5]。因此，UOX 进入人体后，极易被免疫系统识别为外源蛋白，从而引发严重的过敏反应甚至引起过敏性休克。

聚乙二醇（PEG）化重组尿酸氧化酶（PEGrUOX）通过将水溶性大分子聚合物PEG 与rUOX 共价结合成新的修饰药物，降低了其免疫原性，并延长了rUOX在体内的半衰期[6-8]。2010年9月，Savient公司的PEG 化重组猪尿酸氧化酶（pegloticase）在美国上市销售。临床数据表明，PEG 化重组猪尿酸氧化酶每2 周注射1 次，在人体内的半衰期为10.5～19.9 d[9-10]，而未修饰的rUOX 在体内的半衰期仅为19 h；同时该药可以消除已形成的痛风石，从而达到根治石性痛风的作用[11]。目前，国内PEG-rUOX 已进入临床前研究阶段，各厂家的rUOX的一级序列均有所不同，其中一家企业的PEG-rUOX 正在申请临床试验。由于rUOX 本身分子较大，每个亚基上均有20多个PEG 修饰位点，因此修饰后的产物化学结构发生改变，分子大为增加。与原型蛋白相比，其理化性质和生物学活性的巨大变化，为质量控制尤其是修饰产物的蛋白含量测定带来较大的难度。常规的蛋白质含量测定方法如凯式定氮法灵敏度较低，操作繁琐，无法将其应用于常规检测中；而一些基于生化反应的蛋白含量测定方法如Lowry 法、考染法等，受PEG 的干扰较大，PEG 修饰蛋白往往在反应中发生沉淀，PEG 修饰对照品的蛋白含量也因此难以准确赋值。我们以原型蛋白rUOX 作为PEG-rUOX 含量测定的对照品，采用凝胶色谱法，通过详细的方法学考察，建立了较为通用的蛋白质含量测定方法，可同时对2种不同的PEG-rUOX进行准确的含量测定。

1 材料与方法

1.1 材料

2种rUOX 及其PEG-rUOX 原液分别由国内J、M厂家提供；浓盐酸、氯化钠购自国药集团化学试剂有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）购自Amresco 公司；其他试剂非特殊说明均为分析纯级。

pH 酸度计METTLER MP230K、电子天平Mettler Toledo xs205PV（瑞士Mettler 公司）；电子天平AND-HF400（日本AND 公司）；岛津20AT 高效液相泵、岛津SPD20A 检测器、岛津GIL20AC 自动进样器、岛津LTO10AS柱温箱、Solustion 岛津色谱工作站（日本岛津贸易有限公司）；TSK Gel 5000PWxl凝胶色谱柱（日本东洋曹达TOSOH）；XW-80A 涡旋振荡仪（上海精科实业有限公司）。

1.2 紫外吸收波长扫描

将2 种PEG-rUOX 原液及rUOX 自制对照品用超纯水稀释至0.5 mg/mL 左右，置于紫外分光光度计中，700～200 nm扫描。

1.3 流动相和色谱条件

1.3.1 流动相的配制 称取Tris 6.06 g，氯化钠8.77 g，加超纯水800 mL 溶解，用浓盐酸调至pH9.0，定容至1000 mL，抽滤，脱气备用。

1.3.2 色谱条件 用TSK Gel 5000PWxl 凝胶色谱柱，柱温25℃，流速0.5 mL/min，检测波长280 nm。

1.4 专属性及系统适用性

分别将2 种rUOX 自制对照品和PEG-rUOX 原液用流动相稀释至约1 mg/mL，等体积混合，各取10μL 注入液相色谱仪，记录色谱图，计算rUOX和PEG-rUOX 的分离度。另取10μL 流动相注入液相色谱仪，作为空白对照。

1.5 线性

分别取2 种rUOX 自制对照品适量，用流动相稀释至每1 mL 含rUOX 1.0 mg，作为对照品储备液。精密量取该溶液200、160、120、80、40μL，分别置于EP 管中，加入流动相至终体积为200μL，摇匀，制成浓度为1.0、0.8、0.6、0.4和0.2 mg/mL 的系列对照品溶液。按上述色谱条件，各取10μL 注入液相色谱仪，记录色谱图。

1.6 定量限与检测限

取1.5 项下的对照品储备液，用流动相稀释至0.2 mg/mL。取5μL 该溶液加入495μL 流动相，得到0.002 mg/mL 的rUOX 溶液，分别取100、50、40、30、20、15、10、7、5、3、1μL 注入液相色谱仪，记录色谱图。记录信噪比S/N 分别为10∶1（定量限）和3∶1（检测限）时的进样量。

1.7 精密度与稳定性

取2 种浓度为0.6 mg/mL 的rUOX 对照品溶液，按上述色谱条件连续进样5 次，进样量10μL，记录rUOX对照品峰面积及保留时间，计算RSD%。

取2 种浓度为0.6 mg/mL 的rUOX 对照品溶液，放置于4℃温控进样器中，按上述色谱条件分别于0、2、4、6、8、10、12 h 进样10μL，记录rUOX 的峰面积及保留时间，计算RSD%。

1.8 回收率

1.8.1 含量测定 将2 种PEG-rUOX 原液分别用流动相稀释至0.4～0.8 mg/mL，进样10μL，根据相应rUOX的标准曲线计算其蛋白含量。

1.8.2 回收率考察 将2 种PEG-rUOX 原液稀释至0.6 mg/mL，取100μL，分别加入0.6 mg/mL 的rUOX对照品70、100、130μL，制备成低、中、高3 个浓度的供试品溶液，按上述色谱条件进样10μL，记录色谱图，根据相应rUOX的标准曲线，计算加样回收率。

1.9 重现性

2 种PEG-rUOX 注射液各取1 批，分别用流动相稀释至0.6 mg/mL，平行制备6 份，按标准曲线法测定含量，计算RSD%（n=6）。

2 结果

2.1 紫外吸收波长

经波长扫描，2 种PEG-rUOX 原液与rUOX 除214 nm的末端吸收外，在280 nm处存在最大吸收。

2.2 专属性及系统适用性

在建立的色谱条件下，2 种rUOX 与2 种PEGrUOX 均能达到基线分离，2 个厂家的rUOX 与PEGrUOX 在色谱图上的位置相似，典型色谱图见图1。rUOX 与PEG-rUOX 的分离度、二者的理论塔板数及拖尾因子均能满足要求，见表1。

2.3 线性

分别以rUOX峰面积为纵坐标、对照品溶液浓度为横坐标进行直线回归，结果表明在280 nm 下，rUOX 在200～1000μg/mL 浓度范围内具有良好的线性关系，见图2、3。

2.4 定量限及检测限

J 厂家rUOX 浓度为0.002 mg/mL，进样10μL时S/N 为10∶1，进样5μL 时S/N 为3∶1，即M 厂家rUOX的定量限为20 ng，检测限为10 ng。

M 厂家rUOX 浓度为0.002 mg/mL，进样15μL时S/N 为10∶1，进样7μL 时S/N 为3∶1，即J 厂家rUOX的定量限为30 ng，检测限为14 ng。

2.5 精密度与稳定性

2 种rUOX 的5 次进样峰面积的RSD%分别为0.06%和0.2%（n=5），保留时间RSD%均为0.02%（n=5），方法精密度良好。样品12 h 内峰面积RSD%为0.46%，表明rUOX在12 h内具有很好的稳定性。

2.6 回收率

2.6.1 含量测定 M 厂家PEG-rUOX 含量测定结果为0.65 mg/mL，乘以稀释率即得PEG-rUOX 的原液浓度为1.95 mg/mL；J厂家PEG-rUOX含量测定结果为0.62 mg/mL，乘以稀释率即得PEG-rUOX 原液浓度为6.2 mg/mL。

表1 专属性及系统适用性实验结果

2.6.2 回收率考察 将PEG-rUOX 峰面积与rUOX峰面积之和带入标准曲线获得总的含量值，计算回收率：

中浓度回收率=（总的含量值-0.3）÷0.3×100%；

低浓度回收率=（总的含量值-0.353）÷0.247×100%；

高浓度回收率=（总的含量值-0.261）÷0.339×100%。

2 种rUOX 平均加样回收率为98.33%～99.96%，表明该方法准确度高、重复性好，可用于PEG-rUOX原液的准确定量。结果见表2。

2.7 样品测定及重现性

制备多份样品平行测定，J厂家含量测定结果的RSD%为0.40%（n=6），M 厂家为0.48%（n=6）。结果表明，本方法的重现性良好。

3 讨论

3.1 分离方式的选择

一般来说，含量测定首先考虑分辨率较高的反相液相色谱法，但该方法对于PEG-rUOX 而言并没有较大优势。由于PEG 本身为混合物，使得修饰产物在反相色谱上很难以一个对称性很好的色谱峰洗脱出来，连接不同PEG 数量的修饰产物或修饰个数相同的位点异构体往往以肩峰或分叉峰形式洗脱，给准确积分造成较大困难。同时，原型蛋白rUOX本身为含有4 个相同亚基的分子较大的蛋白质，每个亚基中又含有1 个游离的巯基，因此，在以有机相为流动相的反相色谱中难以得到对称性良好、巯基不发生错配的色谱峰。考虑到方法的通用性和积分的准确性，我们选择了凝胶色谱法进行方法优化。

图1 系统适应性色谱图

图2 M厂家rUOX标准曲线图

图3 J厂家rUOX标准曲线图

表2 280 nm波长下PEG-rUOX的回收率

3.2 流动相的选择

本研究分别选用了超纯水、50 mmol/L Tris-HCl（pH9.0）、50 mmol/L Tris-HCl 含150 mmol/L 氯化钠共3 种流动相。用超纯水做流动相时，主峰出峰时间很早，但PEG-rUOX和rUOX对照品的峰型均拖尾严重。以50 mmol/L Tris-HCl 作为流动相时，由于Tris-HCl 的缓冲能力，使体系稳定性增强，rUOX 色谱峰峰型较好，但PEG-rUOX 色谱峰的拖尾却较严重。分析原因，可能是流动相体系的离子强度不够，使分子很大的PEG-rUOX 在色谱柱中与填料的吸附作用较明显而造成拖尾。流动相中加入150 mmol/L 氯化钠后离子强度大为提高，PEGrUOX 的峰型得到明显改善。但由于PEG-rUOX 是不同PEG 修饰个数的混合物，分子有所不同，使得PEG-rUOX 的峰型较宽，而rUOX 的峰型较为尖锐。在此条件下，PEG-rUOX和rUOX 的分离度均大于1.5，可用于PEG-UOX的定量测定。

3.3 柱温的选择

我们分别选用了25℃和30℃柱温。柱温为30℃时，M 厂家的PEG-rUOX 主峰发生分叉，可能是由于温度升高使PEG-rUOX 不同修饰产物之间的分离度变大，但又不能达到基线分离度，因此造成色谱峰分叉，不适合定量分析。25℃时，PEG-rUOX 为单一峰型，对称性良好，可用于定量分析。

3.4 测定波长的选择

2 种rUOX 的氨基酸一级序列有所不同，但每个亚基上可以发生PEG 修饰的位点均有20 多个。J厂家与M 厂家所使用的PEG 相对分子质量均为5000，活化基团均为琥珀酰亚胺酯基，通过与rUOX上的游离氨基（N端的α氨基及Lys的ε氨基）发生反应，生成酰胺键对rUOX进行共价修饰。因此，由于修饰后的分子在PEG 与rUOX 的连接位置处存在羰基等双键，在214 nm 进行含量测定时PEG-rUOX 与rUOX的响应因子必然不同。如果以rUOX 为对照品对PEG-rUOX 进行赋值，如果不采用相对响应因子进行校正，则与真实值相比测定结果势必偏大，从而造成回收率结果偏高。然而，如果在280 nm进行测定则情况完全不同。因为280 nm 为典型的共轭π键吸收，PEG 与rUOX 连接点以及PEG 本身可能的羰基并不对大π键有所贡献。此时再以rUOX 为对照品对PEG-rUOX 中的蛋白含量进行测定，则2 个物质的响应因子应基本一致，回收率结果也证实了这一点。

[1]da Silva Freitasa D,Spencerb P J,Vassão R C，et al.Biochemical and biopharmaceutical properties of PEGylated uricase[J].Int J Pharm,2010,387(1-2):215-222.

[2]Yang X,Yuan Y,Zhan C G,et al.Uricases as therapeutic agents to treat refractory gout:Current states and future directions[J].Drug Dev Res,2012,73(2):66-72.

[3]Colloc'h N,Poupon A,Mornon J P.Sequence and structural features of the T-fold,an original tunnelling building unit[J].Proteins,2000,39(2):142-154.

[4]Wu X W,Muzny D M,Lee C C,et al.Two independent mutational events in the loss of urate oxidase during hominoid evolution[J].J Mol Evol,1992,34(1):78-84.

[5]Oda M,Satta Y,Takenaka O,et al.Loss of urate oxidase activity in hominoids and its evolutionary implications[J].Mol Biol Evol,2002,19(5):640-653.

[6]Jain A,Jain S K.PEGylation:an approach for drug delivery[J].Crit Rev Ther Drug Carrier Syst,2008,25(5):403-447.

[7]Touraine P,D'souza G A,Kourides I,et al.Lipoatrophy in GH deficient patients treated with a long-acting pegylated GH[J].Eur J Endocrinol,2009,161:533-540.

[8]Ganson N J,Kelly S J,Scarlett E,et al.Control of hyperuricemia in subjects with refractory gout,and induction of antibody against poly(ethylene glycol)(PEG),in a phase I trial of subcutaneous PEGylated urate oxidase[J].Arthritis Res Ther,2006,8(1):R12.

[9]Baraf H S,Matsumoto A K,Maroli A N,et al.Resolution of gouty tophi after twelve weeks of pegloticase treatment[J].Arthritis Rheum,2008,58(11):3632-3634.

[10]Reinders M K,Jansen T L.New advances in the treatment of gout:review of pegloticase[J].Ther Clin Risk Manag,2010,6:543-550.

[11]Lipsky P E,Calabrese L H,Kavanaugh A,et al.Pegloticase immunogenicity:the relationship between efficacy and antibody development in patients treated for refractory chronic gout[J].Arthritis Res Ther,2014,16(2):R60.