番茄环斑病毒纳米荧光颗粒试纸条的研制

李鑫，刘卉秋，胡强，曹冬梅，曹际娟

辽宁出入境检验检疫局，辽宁 大连 116001

番茄环斑病毒（Tomato ringspot Nepovirus，ToRSV）是线传病毒组成员，可感染105 属157 种草本和木本植物，主要感染果树和浆果作物，属我国对外的一类检疫性有害生物。ToRSV 的检测方法主要有生物学、血清学和电镜技术，ELISA和PCR 是应用最多的2 种检测方法。但上述技术普遍存在对人员、环境要求高的问题，难以进行现场快速检测。

免疫层析技术是上世纪90 年代发展起来的一种基于抗原抗体反应的简便快速检测技术，该技术已广泛应用于临床、食品安全检测领域。现有的免疫层析产品所使用的标记物多为胶体金和彩色乳胶颗粒，用这些颗粒制成的免疫层析试纸条可以用肉眼直接判读结果，使用起来十分方便。但此类试纸条产品的灵敏性普遍较差，还不能满足快速、高灵敏检测的需要。稀土荧光纳米颗粒含有稀土离子与螯合剂形成的螯合物，该螯合物可在紫外光激发下发射出特征性荧光。我们采用稀土荧光纳米颗粒作为标记物研制的荧光纳米颗粒试纸条，具有检测更为快速、准确的特征，可广泛应用于ToRSV感染组织的现场快速检测。

1 材料与方法

1.1 材料

荧光纳米颗粒及ToRSV多克隆抗体购自深圳易瑞生物技术有限公司；牛血清白蛋白（BSA）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；羊抗鼠IgG 购自中晶生物公司；硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜购自Millipore 公司；所用试剂均为分析纯产品；检测样品由本中心保藏。

1.2 荧光颗粒单抗偶联物的制备

取荧光颗粒50μL（10 mg/mL），加入550μL 50 mmol/L 的MES（pH6.0）、100 mg/mL 的sulfo-NHS和EDC 各200μL，室温摇动30 min；离心，弃上清；用1 mL 50 mmol/L 的MES（pH6.0）重悬颗粒；加入适量单克隆抗体，室温振摇1 h；加入等体积的PBSBSA（BSA 含量2%，pH7.4），继续反应1 h；离心，弃上清；用50 mmol/L 的MES（pH6.0）洗涤颗粒3 次，1 mL/次；用300μL 重悬液［10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），10%蔗糖］重悬颗粒，4℃保存，备用。

1.3 纳米颗粒试纸条的制备

1.3.1 检测线 以多克隆抗体为硝酸纤维素膜上的检测线包被抗原。将稀释好的包被抗原用点膜仪以1μL/cm 的量喷于粘在PVC 底板上的硝酸纤维素膜上，置干燥密闭的37℃真空烘箱内烘烤60 min，取出后放在干燥皿中待用。

1.3.2 质控线 以羊抗鼠IgG 包被硝酸纤维素膜，作为质控线。将稀释好的羊抗鼠IgG 用点膜仪以1μL/cm 的量喷于粘在PVC 底板上的硝酸纤维素膜上，置干燥密闭的37℃真空烘箱内烘烤60 min，取出后放在干燥皿中待用。

1.3.3 试纸条装配 在硝酸纤维素膜的两端分别粘贴吸水垫和样品垫，吸水垫和样品垫均与NC膜重叠3 mm。裁成5 mm宽的条状，4℃干燥保存。

1.4 试纸条特异性的检测

1.4.1 样品提取 取1 g 待检物叶片于洁净塑料袋中，加 入3 mL PBST（1×PBS，0.5% Tween-20，pH7.4），揉搓塑料袋中的叶片，所得汁液即为待测样本。采用小西葫芦花叶病毒（ZYMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、烟草花叶病毒（TMV）、番木瓜环斑病毒（PRSV）、南瓜花叶病毒（SqMV）、烟草环斑病毒（TRSV）、甜瓜坏死斑点病毒（MNSV）和黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）作为特异性检测的参照，取样方法同上。

1.4.2 检测 在反应杯中加入4μL荧光颗粒-单抗偶联物、200μL提取物（汁液），吹打混匀10次，40℃孵育3 min，插入试纸条继续反应5 min，紫外光下肉眼观察结果。

1.5 试纸条稳定性的检测

将试纸条和荧光颗粒及提取液（1×PBST）于37℃放置7 d，每天检测阳性样品，观察其稳定性。

1.6 荧光试纸条与胶体金试纸条灵敏性比较

1.6.1 胶体金试纸条的制备 胶体金试纸条的制备参照Frens的方法[1]。检测时在反应杯中加入适量胶体金-单抗偶联物、200μL提取物（汁液），吹打混匀10 次，40℃孵育3 min，插入试纸条继续反应5 min，肉眼判读结果。

1.6.2 灵敏性比对试验 用PBST 将同一份阳性样本分别稀释至1/8、1/16、1/32、1/64、1/128，分别用胶体金和免疫层析方法进行检测。

2 结果

2.1 荧光纳米颗粒试纸条的制备

试纸条装配结构如图1。在底板上依次紧密搭接的样品垫7、层析膜8和吸水垫9；层析膜8 上设有检测区81和质控区82，检测区81 固定有与ToRSV发生特异性反应的多克隆抗体，质控区82 固定有羊抗鼠IgG。

2.2 特异性检测结果

用制备的荧光纳米颗粒试纸条检测ToRSV及其他8 种参照病毒的阳性样本，除ToRSV 外，其余均无交叉反应。典型实验结果如图2所示。

2.3 稳定性检测结果

将试纸条和荧光颗粒及提取液（1×PBST）于37℃放置7 d，进行连续检测试验，结果表明试纸条和荧光颗粒及反应液的灵敏性没有明显降低，表明该试纸条的稳定性较好。

2.4 荧光试纸条与胶体金试纸条灵敏性比对

灵敏度对比试验结果（表1）显示，当阳性样本稀释至1/32时，胶体金试纸条不能观测到显色反应，而荧光试纸条仍可检出；当稀释到1/64时，荧光试纸条无任何反应。由此可以看出，荧光纳米颗粒试纸条对样品的浓度要求要低于普通胶体金试纸条，其有较高的灵敏性。

图1 试纸条装配结构图

图2 典型实验结果（紫外光下）

表1 不同方法的灵敏性比对

3 讨论

目前，虽然已经有一些用免疫层析试纸条检测微生物的报道[2-3]，但灵敏性都不够理想，标记物的信号强度弱是一个很重要的原因。荧光纳米颗粒中含有多个荧光颗粒，具有良好的发光性能，荧光信号也远远强于传统的标记物质。本研究将免疫层析技术和荧光纳米颗粒标记技术相结合，建立了番茄环斑病毒的免疫层析检测法。该方法的原理、操作过程和结果判读与胶体金免疫层析试纸条相似，但荧光纳米颗粒试纸条在传统胶体金结构上进行了改进，将原来的可结合胶体金颗粒的结合垫取消，改为将荧光颗粒与待测样品相混合的方式，使其充分反应，完全摈弃了胶体金依靠被动物理吸附的标记方式，从而提高了检测效率及荧光信号的强度。目前该试纸条已获国家实用新型专利（ZL201320706434.4）。

免疫学检测技术在植物病毒检测中具有灵敏、特异、简便、高通量等优势，因此得以广泛应用[4]。近20 年来，不断有一些新的免疫学检测技术被应用于微生物的检测中，如时间分辨荧光技术（TRFIA）[5]、酶联免疫吸附试验（ELISA）[6-7]、胶体金免疫层析技术（GCIA）[8]等。高强度的荧光信号保证了检测方法具有良好的灵敏性，且稳定性试验结果说明本研究所建立的免疫层析检测系统亦具有良好的稳定性。

番茄环斑病毒荧光纳米颗粒检测试纸条的研制成功，为该病毒的快速检测提供了一个极好的检测方法，便于现场或田间检测的开展，为生物安全工作提供了便利，也有助于其他植物病毒或微生物的快速检测方法研究。

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[6]朱延书,康宁.生物技术在植物检疫检测中的应用[J].江苏林业科技,2003,30(3):42-44.

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