人脐带间充质干细胞对炎症性肠病小鼠模型的治疗作用

葛翠翠 ，王慧娜，杜丽欣，陈冬波，宋亚昆，2，吴东颖，2，刘兵，邱泽武，吕双红

1.军事医学科学院 附属医院 a.中毒救治科；b.307-青藤转化医学中心；北京 100071；2.北京青藤谷禧干细胞科技研究院有限公司，北京 100071

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一组特发性、慢性、炎症性肠道疾病状态，可以造成肠道结构和功能不可逆的损伤。目前IBD 的治疗主要采用糖皮质激素、水杨酸类、免疫抑制剂等药物，但这些药物很难维持疾病长时间的缓解，复发率很高，且副作用较大，价格昂贵。因此，寻找新的治疗方法以延长缓解期时间，降低致残率，提高患者生活质量，已是亟待解决的难题。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）最早从骨髓中分离，存在于脂肪、脐血、脐带、胎盘、羊膜等多种组织中。MSC具有多向分化、抗炎、免疫调节等潜能，为治疗许多复杂的疾病带来希望。与骨髓来源的MSC 相比，人脐带MSC（umbilical cordderived MSC，UCMSC）来源广泛，易于取材，对供者不造成创伤，无伦理道德限制，并且具有细胞免疫原性低，增殖、分化能力强等优势，因此受到研究人员的广泛青睐。目前已有应用UCMSC 治疗肝硬化、系统性红斑狼疮、多发性硬化等疾病的临床研究报道，并取得了较好的疗效，但在IBD 研究方面尚处于起步阶段。此外，以往的研究中多采用尾静脉注射移植MSC，腹腔注射移植较少。但对于治疗结肠炎而言，腹腔注射更接近损伤部位，且更加简便易行和安全。因此，我们拟探讨2 种途径移植人UCMSC 对TNBS诱导的IBD小鼠模型的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级雄性BALB/c 小鼠，体重18～22 g，由军事医学科学院实验动物中心提供，灌肠前在该中心适应性饲养5～7 d。

1.2 UCMSC的分离培养鉴定

取健康胎儿脐带样品冲洗干净，剪成2～3 mm3的小块，加入1%胶原酶消化液于37℃消化2 h，用70 μm 筛网过滤，收集上清，离心收集细胞，用PBS清洗后，加入5 mL 培养液重悬细胞，于37℃、5%CO2普通培养箱中培养至80%～90%汇合时，按1∶2～1∶3 的比例传代。动物体内移植采用6～8 代细胞。用流式细胞仪检测UCMSC表面标志的表达情况。

1.3 TNBS诱导小鼠IBD模型制备

2，4，6-三硝基苯磺酸（trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）购自Sigma 公司，为5%水溶液。按照4∶1 的比例配制丙酮-橄榄油混合溶剂，然后将该溶剂与TNBS以4∶1混合制备皮肤致敏液。将TNBS 与无水乙醇以1∶1混合制备TNBS灌肠溶液。

模型制备参考Wirtz等[1]的方法。小鼠背部剪去1.5 cm 见方的毛发，露出皮肤，每只小鼠涂150 μL皮肤致敏液后正常饲养，7 d 后用150 mg/kg TNBS灌肠。抚摸小鼠背部刺激远端大便排空；腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉后，倒悬位，将直径0.2 mm聚乙烯管插入结肠4 cm处，缓慢灌入灌肠溶液，放回笼中正常饲养。观察小鼠大便性状、精神状态等，每天记录小鼠体重变化。7 d 后处死，取结肠进行大体评分，并取受损部位石蜡包埋切片，HE 染色后进行病理评分。

小鼠结肠组织大体评分按照Morris[2]的评分标准进行（0 分：大致正常；1 分：无溃疡，局部充血；2分：可见溃疡，但无充血；3 分：仅1 处溃疡和炎症；4分：2 处或更多处的溃疡和炎症；5 分：溃疡长于2 cm；6～10 分：大于2 cm 的溃疡，每增加1 cm 多计1分）。组织学评分参照Appleyard[3]评分标准进行［水肿：0 或1（有或没有）；溃疡：0 或1（有或没有）；细胞浸润：0，1，2 或3（无，轻度，重度）；肌层增厚：0，1，2或3（无，轻度，重度）；血管新生：0 或1（有或没有）；黏膜结构破坏：0 或1（有或没有）；黏膜结构丧失：0，1，2或3（无，轻度，重度）；合计总分］。

1.4 UCMSC输注治疗IBD

小鼠TNBS 灌肠造模后分为3组：对照组（n=8），灌肠后24 h 尾静脉输注PBS；尾静脉治疗组（n=11），灌肠后24 h 尾静脉输注2×105/只；腹腔移植治疗组（n=10），灌肠后24 h腹腔输注2×105/只。

1.5 统计学处理

用SPSS17.0统计软件对实验数据进行分析。计量资料均以表示，组间比较用t检验。

2 结果

2.1 人UCMSC的培养和鉴定

UCMSC 经传代培养后，显微镜下呈梭形，放射状排列生长或旋涡状生长。流式细胞仪检测结果显示（图1）具有MSC 特征性表面标志的表达。三系分化结果表明，可向骨、软骨和脂肪方向分化。

2.2 腹腔和尾静脉输注UCMSC 对小鼠生存率和体重的影响

如图2 所示，腹腔和尾静脉输注UCMSC 均可提高动物生存率，腹腔输注方式在改善小鼠生存率方面要优于尾静脉移植治疗组。

如图3所示，UCMSC移植后，尾静脉移植治疗组体重缓慢回升；腹腔移植治疗组体重在移植后第2 d 降到最低，然后缓慢回升，实验终点体重恢复和尾静脉移植治疗组基本持平；对照组小鼠体重在第2 d体重降到最低，然后维持一个平稳的水平。

图1 人UCMSC的相差显微镜观察（上）及流式细胞鉴定（下）

2.3 大体及病理组织学观察和评分

移植后第5 d，取出小鼠全结肠，在解剖显微镜下观察评分。对照组小鼠结肠全部可见溃疡伴充血、水肿；尾静脉移植治疗组小鼠恢复较好，仅有个别动物有溃疡，且病变较小；腹腔移植治疗组动物结肠溃疡减轻，而且病变范围减小。大体评分结果显示（表1），UCMSC 尾静脉或腹腔移植后均可对溃疡起到修复效果。

结肠石蜡包埋后切片，HE染色，光镜下观察（图4），发现对照组小鼠结肠组织肠壁增厚，黏膜层广泛坏死，大量淋巴细胞浸润全层；尾静脉移植治疗组和腹腔移植治疗组动物有些仅见到肠壁略有增厚，但黏膜完整；有些仅在黏膜层见到轻微缺损，淋巴细胞浸润较对照组减少。少数小鼠仍可见溃疡，大量淋巴细胞浸润并伴有新生血管生成。与对照组相比，2种移植方式的结肠病理评分均显著下降。

3 讨论

图2 小鼠生存曲线图

图3 对照组和治疗组小鼠体重变化

表1 各组小鼠大体评分和病理评分结果

MSC 已用于多种疾病的治疗研究。Tanaka 等[4]将骨髓来源的MSC 经尾静脉植入DSS诱导的IBD 动物模型，证实MSC 可改善肠道损伤和炎症反应，其修复作用主要通过结肠局部抗炎作用完成。González 等[5]研究发现，人脂肪MSC 可提高IBD 小鼠生存率，并且可阻止疾病复发。Zhang 等[6]采用牙龈来源的MSC 通过静脉给药，也观察到GMSC 通过上调抗炎因子、下调致炎因子及氧自由基来修复IBD。这些研究采用不同来源的MSC治疗IBD，都取得了疗效，但这些MSC 仍存在来源有限、增殖能力有限或取材有创伤等缺陷。而UCMSC 因其来源充足，无创，MSC增殖、分化能力强，分泌多种活性因子等优点，近年来广受青睐。但采用UCMSC 治疗IBD的研究报道目前较少。梁璐等[7]应用人UCMSC 对TNBS 诱导的IBD 进行治疗并探讨其机制，发现其可以快速归巢到有炎症的肠道组织，并且可以明显改善结肠炎的临床表现和组织病理改变。

然而，MSC 移植后能否发挥治疗作用受诸多因素的影响，如移植途径、移植数量、移植时机、移植频次等。在移植途径方面，现有基础研究和临床研究多采用静脉输注方式，并取得较好的疗效。但有关MSC 治疗IBD 哪种移植途径最佳问题尚有争论。Castelo-Branco 等[8]报道，颈静脉输注MSC 未归巢到受损肠组织，对TNBS诱导的结肠炎模型没有发挥治疗效果；而经腹腔注射MSC 可归巢到结肠病灶并发挥疗效，其主要分布于黏膜下层、肌层、固有层。Hayashi 等[9]证实，外源性BMSC 经尾静脉注射后不能改善大鼠一般状况且不能修复受损肠组织，局部注射至受损组织边缘效果较好。Ando 等[10]报道，黏膜下注射AT-MSC 到TNBS 诱导的大鼠结肠炎模型内，FISH 检测到Y 染色体标记的AT-MSC 主要分布在肌层和脂肪组织里。本研究探讨了尾静脉和腹腔注射2 条移植途径所产生疗效的差异。研究结果显示，尾静脉和腹腔注射移植UCMSC 均可对溃疡性结肠炎动物模型起到治疗作用，降低大体和病理评分，但2 条途径的疗效无显著差异。从数据上看，在改善生存率方面腹腔输注UCMSC 优于尾静脉移植，而溃疡修复效果上尾静脉移植优于腹腔移植。这可能意味着2种注射方式发挥治疗作用的机理有差异。

图4 结肠大体观察图片

图5 HE染色图片

此外，在移植细胞数量方面，文献报道每只动物一般移植1×106细胞，相当于5×107/kg，虽然取得了一定的疗效，但与临床常用数量1×106/kg 比较，数量过大，因而降低了其对临床应用的指导意义。而在本研究中，我们发现较高细胞数量移植后动物死亡率较高，因此根据预实验结果，采用2×105/只（相当于1×107/kg）进行治疗，结果显示该细胞剂量也能起到治疗作用，人UCMSC 注射移植后动物体重恢复较快，死亡率降低，肠黏膜炎症减轻，大体和病理评分均有所降低。这表明，较低UCMSC 即可对IBD 起到治疗作用，但治疗的最佳细胞数量（范围）及其机理尚须进一步探讨。

本研究表明，采用尾静脉和腹腔2 条途径移植UCMSC 均可对溃疡性结肠炎起到治疗效果，但具体治疗机理尚须进一步探讨。

[1]Wirtz S,Neufert C,Weigmann B,et al.Chemically induced mouse models of intestinal inflammation[J].Nat Protoc,2007,2(3):541-546.

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[7]Liang L,Dong C,Chen X,et al.Human umbilical cord mesenchymal stem cells ameliorate mice trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS)-induced colitis[J].Cell Transplant,2011,20(9):1395-1408.

[8]Castelo-Branco M T,Soares I D,Lopes D V,et al.Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis[J].PLoS One,2012,7(3):1-12.

[9]Hayashi Y,Tsuji S,Tsujii M,et al.Topical implantation of mesenchymal stem cells has beneficial effects on healing of experi-mental colitis in rats[J].J Pharmacol Exp Ther,2008,326(2):523-531.

[10]Ando Y,Inaba M,Sakaguchi Y,et al.Subcutaneous adipose tissue-derived stem cells facilitate colonic mucosal recovery from 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS)-induced colitis in rats[J].Inflamm Bowel Dis,2008,14(6):826-838.