人乳头瘤病毒18型L1蛋白的包涵体和可溶性表达及纯化

麻粉莲，张骞，郑丽舒

中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所，北京 100052

人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）与人类多种疾病的发生有关，宫颈癌与HPV 感染密切相关。HPV L1 蛋白能够自发组装成病毒样颗粒，具有与完整病毒相同的抗原空间表位，免疫后可产生高滴度的中和抗体。因此，L1蛋白是HPV 疫苗研究的主要靶抗原。我们采用GST标记的原核表达系统，构建重组质粒pGEX-4T-1-HPV18 L1，HPV L1融合蛋白在大肠杆菌BL21 中以包涵体和可溶性形式高效表达，并建立了蛋白纯化方法，获得了HPV18 L1蛋白，为研究HPV疫苗奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

大肠杆菌BL21（DE3）和DH5α感受态购于博迈德生物有限公司；pGEX-4T-1和pMD18-T载体均由本实验室保存。凝血酶、谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B购自GE 公司；蛋白marker、T4DNA 连接酶、限制性内切酶购自TaKaRa 公司；尿素、DTT、Tris、IPTG、氧化型和还原型谷胱甘肽购自Promega公司。

1.2 HPV18 L1序列的优化及TA克隆

根据GenBank中HPV18 L1（NC_001357.1）序列和大肠杆菌密码子嗜性优化L1 序列，在5′和3′端分别引入限制性酶切位点EcoRⅠ和XhoⅠ，送Invitrogen 公司合成。将L1 序列连接至pMD18-T 载体，转化宿主菌，测序鉴定。

1.3 重组质粒pGEX-4T-1-HPV18 L1的构建

用EcoR Ⅰ和XhoⅠ双酶切质粒pMD18-THPV18 L1，用T4DNA 连接酶连接于经同样酶切的表达质粒pGEX-4T-1上，将构建的重组质粒pGEX-4T-1-HPV18 L1 转化大肠杆菌BL21，挑选阳性菌落，提取质粒，双酶切和PCR鉴定。

1.4 HPV18 L1蛋白的表达

将鉴定正确的阳性克隆接种于含氨苄西林（l00 μg/mL）的LB 培养基中过夜培养后，按1∶50 的比例转接到LB 培养液中，当菌液D600nm值达0.6 时加入IPTG 于37℃诱导培养4 h（IPTG 终浓度为0.2 mmol/L）或于16℃诱导培养24 h（IPTG 终浓度为0.1 mmol/L），4℃、5000 r/min 离心10 min 收集菌体，重悬于PBS，超声破碎细菌，离心收集上清和沉淀，12% SDS-PAGE鉴定并分析目的蛋白的表达。

1.5 HPV18 L1蛋白的纯化

1.5.1 包涵体纯化 经12% SDS-PAGE 鉴定，37℃诱导时HPV18 L1 蛋白为包涵体形式，在破碎菌体的沉淀内有大量目的蛋白。大量表达HPV18 L1蛋白，收集菌体，PBS 洗涤，加入菌体超声波裂解缓冲液（20 mmol/L Tris-Cl，0.1 mmol/L EDTA，0.5 mol/L NaCl，0.1% TrixtonX-100，pH8.0）破碎菌体，4℃、5000 r/min 离心25 min，弃上清，收集沉淀；沉淀中加入包涵体洗涤液Ⅰ（50 mmol/L Tris-Cl，5 mmol/L EDTA，2 mol/L 尿素，0.5% Triton X-100，pH8.0）洗涤，4℃、12 000 r/min 离心30 min，收集沉淀；沉淀中加入包涵体洗液Ⅱ（50 mmol/L Tris-Cl，pH8.0）洗涤，离心后用双蒸水洗涤沉淀，离心收集沉淀；用包涵体裂解液（50 mmol/L Tris-Cl，2 mol/L 尿素，pH12.0）溶解沉淀，将变性的包涵体装入透析袋，用复性液Ⅰ（50 mmol/L Tris-Cl，0.1 mmol/L DTT，pH8.0）于4℃透析12 h，50 mmol/L Tris-Cl（pH8.0）于4℃透析12 h，复性液Ⅱ（50 mmol/L Tris-Cl，0.2 mmol/L 氧化型谷胱甘肽，1 mmol/L 还原型谷胱甘肽，pH8.0）于4℃透析12 h；透析结束，4℃、12 000 r/min 离心30 min，收集上清和沉淀；包涵体复性产物用0.45 μm 滤器过滤，用GST 4B 纯化试剂盒纯化；用PBS 平衡GST 柱子后将复性产物上样，充分洗去杂蛋白，用还原型谷胱甘肽洗脱目的蛋白，收集不同峰值样品，经12% SDS-PAGE和Western印迹鉴定。

1.5.2 可溶性L1 蛋白的纯化 经12% SDS-PAGE鉴定，16℃诱导时HPV18 L1 蛋白为可溶性表达，在破碎菌体的上清和沉淀内均有目的蛋白。大量表达HPV18 L1 蛋白，超声波破碎菌体，收集上清，进行GST 4B亲和纯化。为去除分子伴侣，在破碎菌体中加入1 mmol/L ATP 孵育30 min，再加入3.5 mol/L尿素孵育30 min，4℃、14 400 r/min 离心75 min，收集上清，进行GST 4B亲和纯化。收集不同峰值的样品，经超滤管浓缩后，用50 mmol/L Tris-Cl（pH8.0）于4℃透析18 h。每毫升蛋白加入20 U 凝血酶，22℃孵育8 h，用Western印迹鉴定酶切结果。

2 结果

2.1 HPV18 L1序列的优化及TA克隆

HPV18 L1 基因全长1602 bp，编码533 个氨基酸残基。按照大肠杆菌密码子嗜性优化L1 基因序列后，密码子适应指数（CAI）由0.228 上升为0.578，密码子偏爱指数（CBI）由-0.09 上升为0.470，氨基酸序列未发生改变。测序结果显示重组质粒pMD18-T-L1的序列正确。

2.2 重组质粒pGEX-4T-1-HPV18 L1 的双酶切和PCR鉴定

用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒pGEX-4T-1-HPV18 L1，同时进行PCR 鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳显示在1600 bp 处均有目的条带（图1），表明L1基因成功插入pGEX-4T-1载体。

2.3 HPV18 L1蛋白原核表达的鉴定

经12% SDS-PAGE 检测，在37℃用0.2 mmol/L IPTG 诱导表达4 h，L1 蛋白以包涵体形式存在，在相对分子质量约86 000 处可见明显条带（图2），与HPV18 L1-GST融合蛋白预期大小吻合。在16℃用0.1 mmol/L IPTG 诱导表达24 h，L1 蛋白为可溶性表达，在破碎菌体的上清和沉淀中均有相对分子质量约86 000的新增条带，上清孔中约60 000的条带为分子伴侣GroEL（图3）。

2.4 包涵体形式表达的HPV18 L1蛋白的纯化

12% SDS-PAGE 结果表明，包涵体经洗涤后杂蛋白减少，目的蛋白含量较高。经碱变性溶解包涵体，大量菌体被溶解。蛋白复性后用GST 4B进行亲和纯化，在相对分子质量约86 000 处有单一条带，为HPV18L1-GST融合蛋白（图4）。

2.5 可溶性形式表达的HPV18 L1蛋白的纯化

将破碎的菌体上清进行GST 4B亲和纯化，发现GroEL 和HPV18L1-GST 融合蛋白共同被纯化，相对分子质量分别为60 000 和86 000。但是，如果在超声波破碎的菌体中加入ATP 和尿素作用后，经GST 4B 亲和层析纯化可得到HPV18 L1-GST 融合蛋白，同时可去除GroEL（图5）。

图1 重组质粒的PCR（A）和酶切（B）鉴定

图2 HPV18 L1表达的SDS-PAGE分析

图3 HPV18 L1不同表达方式的SDS-PAGE分析

图4 以包涵体形式表达的HPV18 L1蛋白的GST 4B纯化

2.6 HPV18 L1-GST融合蛋白的Western印迹鉴定

包涵体形式表达的HPV18 L1-GST融合蛋白纯化后降解条带较多，而可溶性表达的融合蛋白纯化后条带单一，无蛋白降解现象（图6）。

2.7 HPV18 L1-GST融合蛋白的凝血酶酶切

可溶性表达的蛋白纯化后得到的HPV18 L1-GST 融合蛋白条带单一，经凝血酶酶切后可去除GST 标签，Western 印迹检测显示在相对分子质量60 000 处有明显条带，能被HPV18 L1 特异性抗体识别，为HPV18 L1蛋白，相对分子质量42 000处的条带为L1蛋白的降解产物（图7）。

3 讨论

图5 以可溶性形式表达的HPV18 L1蛋白的GST 4B纯化

图6 HPV18L1-GST融合蛋白的Western印迹

图7 HPV18L1-GST融合蛋白的凝血酶酶切

外源基因在大肠杆菌中的高效表达受很多因素的影响。用pUC 表达载体表达HPV18 L1 蛋白时，目的蛋白发生降解，表达量低。本实验采用了带有GST 标签的原核表达载体pGEX-4T-1，GST 既能增加外源蛋白的可溶性，提高蛋白质的表达量，又便于亲合层析纯化目的蛋白。本实验构建了pGEX-4T-1-HPV18 L1 重组质粒，诱导后HPV18 L1 以GST 融合蛋白的形式表达，SDS-PAGE 可见相对分子质量86 000 条带。37℃以0.2 mmol/L 的IPTG 诱导表达4 h，蛋白为包涵体形式，经洗涤、变性、复性和GST 4B 亲和纯化，可获得HPV18 L1-GST 融合蛋白，但降解条带较多。16℃以0.1 mmol/L IPTG 诱导表达24 h，蛋白为可溶性形式，经去除分子伴侣GroEL、GST 4B亲和纯化和凝血酶酶切去除GST标签，可获得HPV18 L1纯化蛋白，但酶切效率有待提高。

尿素、盐酸胍变性会破环蛋白质二级结构，使疏水性氨基酸残基暴露在表面。包涵体溶解与尿素浓度、蛋白质浓度和溶液pH 值有关。本实验中，将包涵体在碱变性条件下溶解，将可溶部分用含有还原剂的中性缓冲液透析促进二硫键正确折叠，多余的还原剂可再次透析除去，大部分包涵体在50 mmol/L Tris（pH12.0）和2 mol/L 尿素中可以溶解。此方法既能保持蛋白质二级结构，又使蛋白质溶解达到最大化[1]。在复性过程中，有许多条件影响目的蛋白的重折叠。一是细菌成分和杂蛋白的影响。低浓度尿素、TritonX-100 和EDTA 有利于除去脂类、脂多糖、核酸等杂质。其次，复性时蛋白质浓度很关键，蛋白质浓度高于1 mg/mL，则复性得率低于10%，蛋白质浓度为10～50 μg/mL时复性得率最高。三是小分子添加剂的使用。L1 蛋白含有12 个半胱氨酸残基，为高度富含二硫键的蛋白质，DTT、氧化型和还原型谷胱甘肽能够促进L1蛋白的正确折叠。

将可溶性HPV18 L1 蛋白进行GST 4B 亲和层析纯化，同时得到分子伴侣GroEL 和HPV18L1-GST融合蛋白，这与Chen 的报道一致[2]。在蛋白质折叠过程中，GroEL 结合伸展的肽链或折叠的中间态，并在ATP 和GroES 的作用下，水解ATP 释放底物蛋白质和能量，促进底物蛋白质的折叠。GroEL 可通过不同的作用力与各种底物结合，利用层析技术也不能使其分开，说明两者之间存在相互作用。去除与底物多肽紧密结合的GroEL 有三种方法：一是通过ATP 和大肠杆菌变性蛋白质的作用可以有效去除GroEL[3]，但考虑到大肠杆菌变性蛋白中杂带较多，我们未采取此方法。二是改变GroEL 的基因片段，使后期纯化时无GroEL 存在[4]。三是ATP 和尿素共同作用去除GroEL。GroEL 具有ATP 激酶活性[5]。ATP 水解是诱导GroEL 构象变化的关键，在ATP 的作用下，分子伴侣与目的蛋白之间从紧密结合变成疏松结合状态。3.5 mol/L尿素可以打乱GroEL二级结构[6]。ATP 结合GroEL 后，尿素能进一步诱导GroEL 和底物蛋白质解聚，将目的蛋白从GroEL 上释放出来，本研究即采用此法。

大肠杆菌表达系统是表达外源蛋白质的首选系统。若大肠杆菌中表达的蛋白折叠成对热不稳定的中间体，便会促进包涵体形成。低温表达可降低翻译速率，使蛋白质有足够时间正确折叠，并能减少重组蛋白的热变性，因此，低温培养条件能在一定程度上抑制包涵体的形成。虽然低温表达时延长了外源蛋白诱导时间，但相对于其后包涵体变性、复性等步骤的繁琐，目的蛋白含量的损失和天然活性的丧失，本实验选择低温表达HPV18 L1 蛋白是可行的。本研究建立了HPV18 L1 融合蛋白的纯化方法，酶切去除了GST 标签，获得了HPV18 L1 蛋白，是后续疫苗研发的基础。

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