广西壮族、汉族系统性红斑狼疮与Toll样受体9基因多态性研究

温斯健 吴飞云 林有坤 方玲

广西壮族、汉族系统性红斑狼疮与Toll样受体9基因多态性研究

温斯健 吴飞云 林有坤 方玲

目的探讨TLR9单核苷酸多态性与广西系统性红斑狼疮(SLE)患者发病的相关性,以及其在壮族、汉两个民族间的差异。方法聚合酶链反应-限制性酶切技术、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术(PCR-RFLP)对97例广西SLE患者和202例广西健康对照者的TLR9基因多态性进行检测,分析其基因型和等位基因频率与SLE部分临床实验室指标的关联性,并比较两民族间的差异。结果TLR9 rs352140CC、CT、TT基因型频率在汉族SLE组与汉族对照组中分别为42.9%、41.1%、16.1%和38.3%、55.8%、5.8%,差异有统计学意义(P＜0.05),其C、T等位基因频率差异无统计学意义(P＞0.05)。TLR9rs352140 C/T基因型频率和等位基因频率在壮族SLE组与壮族健康对照组间、壮族SLE组与汉族SLE组间差异无统计学意义(均P＞0.05)。TLR9 rs352140TT基因型频率在ds-DNA阳性组比阴性组高(P＜0.05),而T等位基因频率在两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。TLR9 rs352140TT基因型频率和T等位基因的频率在SLEDAI≥9组比SLEDAI＜9组高,差异有统计学意义(均P＜0.05)。TLR9 rs352140TT基因型频率和T等位基因的频率在ANA阳性组与阴性组间差异无统计学意义(均P＞0.05)。结论TLR9 rs352140基因多态性可能与广西汉族人SLE的易感性有关,TLR9基因多态性与部分SLE指标可能具有相关性。

红斑狼疮,系统性;Toll样受体9;多态性,单核苷酸;壮族;汉族

作者单位:530021南宁,广西医科大学第一附属医院皮肤性病科(温斯健、吴飞云、林有坤);广西医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室(方玲)

系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫性疾病,发病机制迄今不明,免疫和遗传在其发病中都起了重要作用[1]。随着Toll样受体(TLR)家族的发现,天然免疫在SLE发生发展中的作用越来越受重视[2]。TLR与配体结合后激活天然免疫进而获得特异性免疫,在两者之间起桥梁作用,并参与免疫缺陷性疾病、异常免疫应答性疾病等的发病[3]。TLR9由于特异性识别非甲基化的CpG-DNA序列,在自身免疫性疾病中发挥作用[4]。本研究探讨TLR9分子单核苷酸多态性与广西SLE发病的相关性并比较两民族间的差异。

对象与方法

一、对象

2010年5月至2013年1月广西医科大学第一附属医院皮肤性病科住院的SLE患者97例,其中壮族41例,男5例,女36例,年龄11～60岁,平均(34.1±10.7)岁;汉族56例,男6例,女50例,年龄9～72岁,平均(34.4±12.2)岁。所有患者均符合美国风湿病协会1997年修订的SLE诊断标准[5],首次诊断而住院,入院前从未用糖皮质激素、免疫抑制剂、免疫调节剂等,未合并其他结缔组织病、肿瘤、糖尿病等系统性疾病。对照组202例为同期在本院健康体检者。其中壮族82例,男8例,女74例,年龄15～60岁,平均(33.1±10.1)岁;汉族120例,男15例,女105例,年龄12～68岁,平均(36.6±10.8)岁。以上均为广西籍人且3代内均为纯壮族或汉族血统,相互间无亲缘关系。各组间在性别、年龄比例上均衡可比(均P＞0.05)。本研究获医院伦理委员会批准,均签署知情同意书。

二、方法

1.标本采集及基因组DNA提取:采集各对象外周静脉血2 ml置于EDTA抗凝管中,按DP1802全血基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型,带蛋白酶K,北京Bioteke公司)说明书提取白细胞基因组DNA,-80℃冻存备用。

2.引物设计:参照GenBank中TLR9基因的引物序列运用primer5.0设计引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物的核苷酸序列上游引物5'-AAAGAAGGCCAGGTAATTGTCA-3';下游引物5'-TGCTAGACCTGTCCCACAATAA-3'。扩增产物长度431 bp,引物的退火温度为58℃。PCR反应:按照BioTeke的2×Power Taq PCR MasterMix试剂盒说明书操作。PCR反应体系如下:2×MasterMix 25 μl,上、下游引物各 2 μl,模板 6 μl,补双蒸水15 μl至总体积50 μl。在德国Biometra公司梯度PCR仪进行循环,反应参数:预变性95℃3min;变性95℃ 30 s;退火58℃ 30 s;延伸72℃ 45 s,总共35个循环,最后延伸72℃ 10min。

3.限制性酶切反应及限制性片段长度多态性分析:用限制性核酸内切酶Bsh1236I(BstUI)对PCR产物进行酶切。酶切反应体系如下:无核酸酶水9 μl,10 × 缓冲液 1 μl,Bsh1236I 1 μl,PCR 扩增产物 5 μl。轻轻混匀并置于37℃恒温水浴箱中酶切至少4 h。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳,根据凝胶成像结果,随机抽取酶切成1、2、3条条带的样本各10个,将其PCR产物送上海英骏生物技术有限公司广州分公司进行序列测定,结果回报后使用Chromas软件打开DNA序列并读取和记录。

4.统计学处理:计算各组基因型和等位基因频率,数据输入SPSS16.0软件包,然后确认其是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。多态性位点基因型频率和等位基因频率比较采用χ2检验和校正χ2检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、PCR扩增产物电泳图

TLR9基因的PCR扩增产物的电泳图,可见到明亮的、单一的431 bp的目的基因条带,没有非特异性扩增产物,见图1。

图1 TLR9基因PCR产物电泳图1～4,6～8:DNA PCR 431 bp目的条带;5:空白对照;M:标准参照物

二、PCR产物的限制性酶切的电泳结果

根据酶切图谱知限制性核酸内切酶Bsh1236I(BstUI) 特异酶切序列为5'…CGCG…3'和3'…GCGC…5'。TLR9 rs352140存在多态性,其扩增产物经限制性核酸内切酶酶切后:CC基因型可以被Bsh1236I(BstUI)酶切,产生371 bp和60 bp 2条带;TT基因型不能被酶切,只有431 bp 1条带;CT杂合子可见431 bp、371 bp和60 bp 3条带。TLR9 rs352140酶切产物电泳图见图2。

图2 TLR9rs352140 C/T酶切图谱 1、6、8:CC 基因型;3、5、7、10:CT基因型;9:TT基因型;2;空白对照组;4:标准参照物

三、PCR扩增产物测序结果

TLR9 rs352140C/C、C/T、T/T 基因型扩增产物测序图分别见图3～5。

图3 TLR9rs352140C/C基因型扩增产物测序图(下划线为C等位基因)

图4 TLR9rs352140C/T基因型扩增产物测序图(下划线为C/T杂合子)

图5 TLR9rs352140T/T基因型扩增产物测序图(下划线为T等位基因)

四、TLR9rs352140C/T多态性与广西壮族、汉族SLE的相关性分析

经卡方检验,SLE组和对照组TLR-9基因rs352140C/T等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律,说明群体基因遗传平衡,数据来自同一蒙德尔群体(P＞0.05)。从表1可以看到,TLR9rs352140基因型及等位基因频率在SLE组与对照组间,差异无统计学意义(均P＞0.05)。进一步按壮族、汉族进行分组后发现,TLR9 rs352140CC、CT、TT基因型频率在汉族SLE组与汉族对照组中分别为42.9%、41.1%、16.1%和38.3%、55.8%、5.8%,差异有统计学意义(P=0.044),其C、T等位基因频率差异无统计学意义(P＞0.05)。TLR9rs352140 C/T基因型频率和等位基因频率在壮族SLE组与壮族对照组间、壮族SLE组与汉族SLE组间差异无统计学意义(均P＞0.05),见表2。

表1 TLR9rs352140基因型及等位基因频率与广西SLE组及对照组的差异性比较分析[例(%)]

表2 TLR9rs352140C/T基因型及等位基因频率与广西壮族、汉族SLE的相关性分析[例(%)]

五、TLR9 rs352140 C/T多态性位点与广西SLE患者的临床及实验室指标的比较分析

表3 TLR9 rs352140C/T多态性位点与广西SLE部分指标的比较分析[例(%)]

表3显示了TLR9 rs352140的基因型频率和等位基因频率与97例SLE患者按ds-DNA阳性与阴性、ANA阳性与阴性、SLEDAI≥9分与＜9进行分组后的比较分析情况。在校正了性别、年龄等混杂因素后,χ2检验结果显示,TLR9 rs352140 TT基因型频率在ds-DNA阳性组比阴性组高(P＜0.05),而T等位基因频率在两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。TLR9 rs352140 TT基因型频率和T等位基因的频率在SLEDAI≥9组比SLEDAI＜9组高,差异有统计学意义(均P＜0.05)。TLR9 rs352140 TT基因型频率和T等位基因的频率在ANA阳性组与ANA阴性组间,差异无统计学意义(均P＞0.05)。

讨 论

近年来研究表明,TLR9在天然免疫和体内抗体的形成中起重要作用。Ichikawa等[6]研究表明,TLR9可以与细菌CpG基序结合,进而激活抗原提呈细胞识别细菌和自身抗原,打破自身免疫耐受。最近有研究表明,不仅病原微生物的CpG DNA可以被TLR9识别,而且哺乳动物本身的内源性配体,即低甲基化核酸序列也可以被TLR9识别。SLE患者的DNA甲基化酶活性降低,引起DNA低甲基化增多,同时还因为患者细胞凋亡增加,从而使患者血清中低甲基化的DNA升高。这些低甲基化的DNA就可以与TLR9结合,诱导机体产生抗dsDNA抗体。刘慧敏等[7]研究发现,抗dsDNA抗体的产生需TLR9参与,用氯喹阻断TLR9 CpG DNA信号传导路径后,抗dsDNA抗体的产生明显下降。

TLR9存在基因多态性。宋卫青等[8]报道,TLR9 rs187084C/T基因型频率和等位基因频率与汉族人群SLE无关,但发现TLR9基因表达增高。Xu等[9]发现,TLR9 rs352140的多态性可能与SLE的易感性有关。日本[10]、丹麦[11]等学者发现,TLR9多个位点的基因多态性与SLE易感性有关,TT基因型频率在SLE组较正常组高。本研究发现,TLR9 rs352140基因多态性在汉族SLE患者与汉族健康对照者间存在差异,TT基因型频率在汉族SLE患者比汉族健康对照者高,但在壮族、汉族SLE患者间,壮族SLE患者与壮族健康者间,以及壮族、汉族正常人之间不存在差异,提示TLR9 rs352140TT基因型有可能是广西汉族SLE的危险基因型,与上述研究结果类似。研究还显示,SLE组中TLR9 rs352140TT基因型频率和(或)T等位基因频率与抗dsDNA抗体阳性、SLEDAI等SLE活动指标之间存在具有统计学意义的关联性,提示TLR9有可能介导SLE疾病活动性。人TLR9基因位于第3号染色体(3p21.3)上,含有两个外显子,第2个外显子为主要编码区域,rs352140位点就位于第2个外显子上,该位点突变可能会增强TLR9的表达和功能,并通过其连锁基因增强基因表达而增加SLE易感性,使得dsDNA抗体的产生增加,并进一步影响SLE的活动度。但这种相关性是否仅由汉族患者所引起,由于病例数偏少未能分组进行统计分析而未能明确。

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2013-11-26)

(本文编辑:吴晓初)

Associations between Toll-like receptor 9 gene polymorphisms and systemic lupus erythematosus in Guangxi Zhuang and Han populations

Wen Sijian*,Wu Feiyun,Lin Youkun,Fang Ling.*Department of Dermatology and Venereology,First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China

Lin Youkun,Email:linyoukun7@aliyun.com

ObjectiveTo assess the association between Toll-like receptor 9(TLR9)gene single nucleotide polymorphisms(SNPs)and systemic lupus erythematosus(SLE)development in Guangxi Zhuang and Han populations,as well as the difference in TLR9 SNPs between the two populations.MethodsTotally,41 SLE patients of Zhuang nationality and 56 of Han nationality,as well as 82 healthy checkup examinees of Zhuang nationality and 120 of Han nationality were enrolled in this study.Venous blood samples were obtained from all of these subjects and subjected to DNA extraction.The single nucleotide polymorphisms in TLR9 gene were detected by PCR-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)analysis followed by direct sequencing.Chi-square test and adjusted Chi-square test were conducted to assess the relationship between the genotype and allele frequencies of TLR9 SNPs and some clinical and laboratory parameters of patients with SLE,as well as the differences in genotype and allele frequencies of TLR9 SNPs between the two populations.ResultsThe frequencies of CC,CT and TT genotypes of TLR9 SNP rs352140 were 42.9%,41.1%and 16.1%respectively in the patients of Han nationality,compared to 38.3%,55.8%and 5.8%in the healthy controls of Han nationality(allP＜0.05),but no significant difference was observed in the frequency of C or T allele of the SNP rs352140 between the patients and controls of Han nationality(bothP＞0.05).There was no significant difference in the genotype or allele frequency of TLR9 SNP rs352140 between the patients and healthy controls of Zhuang nationality,or between the patients of Han nationality and Zhuang nationality(allP＞0.05).The patients with anti-dsDNA antibodies showed a significantly higher frequency of TT genotype(P＜0.05),but similar T allele frequency at TLR9 SNP rs352140(P＞0.05)compared with those without.The frequencies of both TT genotype and T allele of TLR9 SNP rs352140 were significantly increased in the patients with a SLE disease activity index(SLEDAI)≥9 compared with those with a SLEDAI＜9(bothP＜0.05).There was no statistical difference in either the TT genotype or the T allele frequency at TLR9 SNP rs352140 between antinuclear antibody-positive and-negative patients with SLE(bothP＞0.05).ConclusionsThe TLR9 SNP rs352140 is correlated with several clinical and laboratory parameters of SLE,and might contribute to the susceptibility to SLE in Guangxi Han population.

Lupus erythematosus,systemic;Toll-like receptor 9;Polymorphism,single nucleotide;Zhuang nationality;Han nationality

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.06.008

广西自然科学基金(2010GXNSFA013186)

林有坤,Email:linyoukun7@aliyun.com