瘦素调节HaCaT细胞角蛋白17的表达

张敏 苗叶 薛柯 李承新

瘦素调节HaCaT细胞角蛋白17的表达

张敏 苗叶 薛柯 李承新

目的探讨瘦素对HaCaT细胞角蛋白17(K17)表达的影响。方法体外培养HaCaT细胞,给予100 ng/ml的瘦素作用24 h,应用实时PCR检测K17 mRNA表达水平、Western印迹及免疫荧光染色法检测K17蛋白表达水平变化。结果与阴性对照组(1.000 0±0.000 0)相比较,瘦素组(3.086 7±0.186 1)K17 mRNA表达显著升高,差异有统计学意义(P＜0.01)。Western印迹结果表明,瘦素组K17蛋白较阴性对照组显著上调,细胞免疫荧光染色结果与RT-PCR、Western印迹结果相符。与单纯使用瘦素组(2.242 7±0.188 7)相比较,STAT3抑制剂组和Erk1/2抑制剂组K17 mRNA分别为0.674 1±0.060 0、0.855 0±0.390 3,Western印迹和细胞免疫荧光染色显示,两个抑制剂组的K17蛋白较瘦素组均显著下调,差异均有统计学意义(P＜0.01)。结论瘦素可以诱导HaCaT细胞表达K17,其机制可能与激活STAT3、Erk1/2信号转导途径有关。

HaCaT细胞;瘦素;角蛋白17

作者单位:710032西安,第四军医大学西京皮肤医院

瘦素(leptin)由肥胖基因编码的非糖基化蛋白类激素,相对分子质量为16 000,主要由白色脂肪分泌,瘦素受体表达于卵巢、骨骼肌、胃、脑垂体及肝脏等多种组织部位,瘦素与受体结合后在抑制食欲、能量代谢、神经-内分泌-免疫功能中发挥生理功能[1]。近年来有报道,对肥胖治疗后有助于银屑病好转,提示肥胖与银屑病相关,而瘦素是参与机体代谢的脂肪因子[2]。我们前期研究发现,瘦素对角质形成细胞活性及细胞周期、细胞增殖会产生影响,并能刺激角质形成细胞产生炎症因子IL-6,IL-8,TNF-α,免疫组化检测正常人与银屑病患者皮损组织瘦素水平,瘦素在银屑病患者皮损中过度表达,提示瘦素可能参与银屑病表皮过度增生增殖,但瘦素在银屑病病理生理过程中的作用尚不明确[3]。角蛋白17作为银屑病相关性细胞角蛋白在正常皮肤中不表达,而在银屑病患者皮损区则特异性高表达[4],其表达水平与银屑病过程和严重程度有一定相关[5-6]。本研究探讨瘦素是否对HaCaT细胞角蛋白17表达有调控作用。

材料与方法

一、材料

HaCaT细胞株购于美国ATCC公司(本科常规保存),重组人瘦素购于美国Peprotech公司(300-27),DMEM/F12培养液购于美国Hyclone公司,总RNA提取试剂盒、SuperScriptⅡ反转录试剂盒购于日本TaKaRa公司,兔抗人K17单克隆抗体购于美国Epitomics公司,兔抗人β肌动蛋白单克隆抗体购于美国Sigma公司,BCA试剂盒购于上海碧云天生物技术公司,HRP标记的羊抗兔IgG抗体、Cy3标记山羊抗兔IgG购于康为世纪生物科技公司,STAT3通路抑制剂Piceatannol、Erk1/2抑制剂PD-98059购于瑞士Enzo公司。

二、方法

1.细胞培养与处理:HaCaT细胞制成单细胞悬液,分别接种于75 cm2或175 cm2细胞培养瓶,置于37℃、5%CO2孵箱培养,贴壁生长后,换无血清DMEM/F12培养基,饥饿培养24 h使细胞同步化后,加入100 ng/ml瘦素的DMEM/F12培养基作用HaCaT细胞,以不加瘦素处理为阴性对照组。HaCaT细胞经上述处理24 h后检测K17 mRNA及蛋白表达水平。

2.实时PCR检测K17 mRNA表达:用Trizol试剂提取培养的2组HaCaT细胞的总RNA,用反转录试剂盒进行cDNA逆转录,并以此为模板进行实时PCR检测。反应条件为:95℃预变性30 s,95℃5 s,60℃30 s,72℃45 s,循环次数40次,最后73℃延伸5min,以β肌动蛋白作内参照。K17上游引物:5'-ATGGATCCATGACCATGCAGGCCTTGGAGA-3',K17下游引物:5'-AGGAATTCTCACGTCTTCACATC CAGCAGGA-3',β肌动蛋白上游引物:5'-CACGAT GGAGGGGCCGGACTCATC-3',β肌动蛋白下游引物:5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'。

3.Western印迹检测K17蛋白表达:收集2组细胞,提取蛋白并用BCA试剂盒进行蛋白定量后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(5%浓缩胶,10%分离胶)。PVDF膜经甲醇激活后,选用半干转膜法,经固定转膜电压20 V转膜22min。转膜后,室温条件下,用TBST稀释的5%脱脂奶粉封闭2 h,单克隆兔抗人K17抗体(1∶2 000)孵育于4℃过夜,HRP标记的羊抗兔IgG抗体(1∶2 000)37℃孵箱孵育1 h。使用化学发光法,经胶片显影检测结果。

4.免疫荧光染色法检测K17蛋白表达:HaCaT细胞以1.0×103密度进行细胞爬片,按上述方法处理后培养24 h;使用4℃冷丙酮固定,再用0.5%的TritonX-100室温破膜处理10min;PBS漂洗后,加入兔抗人K17单克隆抗体(1∶1 000)置于4℃湿盒过夜;Cy3标记羊抗兔IgG荧光抗体(1∶100)避光置于37℃孵箱1 h;DAPI细胞核染料(1∶1 000)室温孵育10min;95%缓冲甘油封片;激光共聚焦显微镜观察荧光染色结果。

5.STAT3抑制剂及ERK1/2抑制剂对瘦素表达K17的影响:细胞处理同1,饥饿培养24 h后,分别加入含100 ng/ml瘦素、Piceatannol+100 ng/ml瘦素、PD-98059+100 ng/ml瘦素的DMEM/F12培养基,分别在培养24 h后用实时PCR、Western印迹、免疫荧光染色法检测K17 mRNA及蛋白表达情况。

6.统计学方法:所有数据用SPSS16.0统计软件分析,各组检测数据均以±s表示,各组用两样本t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、瘦素对HaCaT细胞K17 mRNA及蛋白表达的影响

HaCaT细胞经100 ng/ml瘦素处理24 h后,与阴性对照组经PBS处理后HaCaT细胞相比,瘦素组K17 mRNA表达(3.0867±0.1861)与阴性对照组(1.0000±0.0000)相比,差异有统计学意义(t=19.421,P＜0.01),且蛋白表达量上调明显(图1),说明瘦素能够诱导HaCaT细胞K17 mRNA及蛋白的表达。

图1 Western印迹检测瘦素作用于HaCaT细胞诱导K17蛋白表达结果

二、瘦素对HaCaT细胞表达K17免疫荧光检测

图2 免疫荧光检测瘦素作用于HaCaT细胞诱导K17蛋白表达(×400) K17在胞质中表达红色荧光,蓝色荧光为DAPI复染细胞核。2a:阴性对照组;2b:瘦素组

HaCaT细胞经100 ng/ml瘦素处理24 h行细胞爬片,经过免疫荧光染色,置于激光共聚焦显微镜下(×400)观察荧光强度。红色为胞质中K17蛋白荧光染色,蓝色为细胞核,与阴性对照组相比,瘦素处理后的HaCaT细胞胞质中K17蛋白的红色荧光明显增强(图2),说明瘦素可诱导HaCaT细胞表达K17,与RT-PCR、Western印迹结果一致。

三、STAT3抑制剂piceatannol和Erk1/2抑制剂PD-98059对瘦素刺激HaCaT细胞K17 mRNA表达的影响

实时PCR检测发现,抑制剂与瘦素联合处理组HaCaT的K17 mRNA表达较瘦素组显著下降,说明STAT3抑制剂Piceatannol和 Erk1/2抑制剂 PD-98059可明显下调瘦素所诱导的HaCaT细胞K17 mRNA的表达(表1)。

表1 STAT3抑制剂Piceatannol和Erk1/2抑制剂PD-98059对瘦素刺激HaCaT K17 mRNA表达结果

四、STAT3抑制剂Piceatannol和Erk1/2抑制剂PD-98059对瘦素刺激HaCaT细胞 K17蛋白表达的影响

Western印迹检测发现,抑制剂与瘦素联合处理组HaCaT细胞的K17蛋白表达较瘦素组显著下降,说明STAT3抑制剂Piceatannol和Erk1/2抑制剂PD-98059可明显下调瘦素所诱导的HaCaT细胞K17蛋白的表达(图3)。

图3 Western印迹检测STAT3和ERK1/2通路抑制剂下调K17蛋白表达结果 1:阴性对照组;2:瘦素组;3:Piceatannol+瘦素组;4:PD-98059+瘦素组

五、STAT3抑制剂Piceatannol和Erk1/2抑制剂PD-98059对瘦素刺激HaCaT细胞 K17蛋白细胞免疫荧光的影响

细胞免疫荧光染色显示,STAT3通路抑制剂Piceatannol和ERK1/2通路抑制剂PD-98059处理组的K17蛋白的表达较瘦素组显著下降,说明STAT3和ERK1/2通路抑制剂能够下调瘦素所诱导的HaCaT细胞表达K17蛋白,与实时PCR、Western印迹结果一致(图4)。

图4 免疫荧光检测通路抑制剂对瘦素作用于HaCaT细胞诱导K17蛋白表达(×400) 阴性对照组K17表达较弱,瘦素处理细胞后K17表达明显增强,蛋白表达显著高于阴性对照组。STAT3和ERK1/2通路抑制剂分别预处理细胞后加用瘦素刺激,可见K17红色荧光强度减弱。4a:阴性对照组;4b:瘦素组;4c:Piceatannol+瘦素组;4d:PD-98059+瘦素组

讨 论

Chen等[7]研究了77例银屑病患者,与对照组进行年龄和性别匹配,发现银屑病组的瘦素高于对照组4.57倍。我们前期统计99例寻常型银屑病患者临床特征发现,超重和肥胖人群罹患银屑病的风险显著升高,瘦素水平与BMI指数、PASI评分都呈正相关,100 ng/ml瘦素作为最佳作用浓度,可调控角质形成细胞释放细胞因子和趋化因子,提示瘦素可能通过调控淋巴细胞和角质形成细胞生物功能参与肥胖银屑病发展[3]。有研究显示,肥胖是罹患银屑病的高风险因素,瘦素与银屑病的病情严重程度存在紧密联系,提示瘦素可能参与肥胖个体银屑病的发生及发展[8-9]。

本研究显示,瘦素可以诱导角质形成细胞高表达K17。K17被视为银屑病自身靶抗原,与链球菌M6蛋白有着相同的ALEEAN氨基酸序列[10],还含有多个银屑病特异性T细胞表位,因此能够通过类似于M6蛋白的作用方式活化T细胞,刺激T细胞增殖并促进其释放相应的细胞因子,引起一系列的应答反应参与银屑病免疫紊乱的维持[11-12]。我们推测瘦素可能通过上调角质形成细胞角蛋白K17表达,与T细胞结合后,增加T细胞的活性状态,参与T细胞及其活化后分泌的细胞因子影响表皮增生及凋亡调控基因的表达影响KC的增生,形成一个恶性循环。有研究证实,瘦素可以通过STAT3通路促进角质形成细胞增殖,从而导致表皮增生[13]。本研究还发现,瘦素可经STAT3抑制剂和Erk1/2抑制剂与瘦素联合作用后,明显抑制K17表达。Miyoshi研究发现该通路在银屑病皮损区域也有异常的表达,应用小分子STA-21抑制STAT3的核转位后,可明显改善银屑病皮损,说明STAT3可作为银屑病治疗的靶点[14]。

[1]Lam QL,Lu L.Role of leptin in immunity[J].Cell Mol Immunol,2007,4(1):1-13.

[2]Davidovici BB,Sattar N,Prinz J,et al.Psoriasis and systemic inflammatory diseases:potential mechanistic links between skin disease and co-morbid conditions[J].J Invest Dermatol,2010,130(7):1785-1796.

[3]Xue K,Liu H,Jian Q,et al.Leptin induces secretion of proinflammatory cytokines by human keratinocytesin vitro--a possible reason for increased severity of psoriasis in patients with a high body mass index[J].Exp Dermatol,2013,22(6):406-410.

[4]Leigh IM,Navsaria H,Purkis P E,et al.Keratins(K16 and K17)as markers of keratinocyte hyperproliferation in psoriasisin vivoandin vitro[J].Br J Dermatol,1995,133(4):501-511.

[5]王刚,刘玉峰.治疗银屑病的一个新的药物作用靶标-角蛋白[J].中国皮肤性病学杂志,2005,19(12):753-754.

[6]张巍,史晓蔚,呼蕾,等.白介素调控角质形成细胞表达角蛋白的研究[J].临床皮肤科杂志,2011,40(4):199-202.

[7]Chen YJ,Wu CY,Shen JL,et al.Psoriasis independentlyassociated with hyperleptinemia contributing to metabolic syndrome[J].Arch Dermatol,2008,144(12):1571-1575.

[8]Wang Y,Chen J,Zhao Y,et al.Psoriasis is associated with increased levels of serum leptin[J].Br J Dermatol,2008,158(5):1134-1135.

[9]Cerman AA,Bozkurt S,Sav A,et al.Serum leptin levels,skin leptin and leptin receptor expression in psoriasis[J].Br J Dermatol,2008,159(4):820-826.

[10]Gudmundsdottir A S,Sigmundsdottir H,Sigurgeirsson B,et al.Is an epitope on keratin 17 a major target for autoreactive T lymphocytes in psoriasis?[J].Clin Exp Immunol,1999,117(3):580-586.

[11]Valdimarsson H,Sigmundsdóttir H,Jónsdóttir I.Is psoriasis induced by streptococcal superantigens and maintained by M-proteinspecific T cells that cross-react with keratin?[J].Clin Exp Immunol,1997,107 Suppl 1:21-24.

[12]Sigmundsdottir H,Sigurgeirsson B,Troye-Blomberg M,et al.Circulating T cells of patients with active psoriasis respond to streptococcal M-peptides sharing sequences with human epidermal keratins[J].Scand J Immunol,1997,45(6):688-697.

[13]Goren I,Pfeilschifter J,Frank S.Determination of leptin signaling pathways in human and murine keratinocytes[J].Biochem Biophys Res Commun,2003,303(4):1080-1085.

[14]Miyoshi K,Takaishi M,Nakajima K,et al.Stat3 as a therapeutic target for the treatment of psoriasis:a clinical feasibility study with STA-21,a Stat3 inhibitor[J].J Invest Dermatol,2011,131(1):108-117.

2013-10-14)

(本文编辑:吴晓初)

Leptin regulates keratin 17 expression in HaCaT human keratinocytes

Zhang Min,Miao Ye,Xue Ke,Li Chengxin.Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China

Li Chengxin,Email:chengxinderm@163.com

ObjectiveTo evaluate the effect of leptin on K17 expression in HaCaT human keratinocytes.MethodsSome cultured HaCaT cells were treated with leptin(100 ng/ml)or remained untreated for 24 hours followed by the quantification of K17 mRNA expression by real-time PCR and detection of K17 protein expression by Western blot and immunofluorescence staining.To investigate the action mechanism of leptin,some cultured HaCaT cells were divided into several groups to be treated with leptin(100 ng/ml)alone,Piceatannol(an inhibitor of the STAT3 pathway)+leptin(100 ng/ml),PD-98059(an inhibitor of the Erk1/2 pathway)+leptin(100 ng/ml),respectively for 24 hours,with the cells receiving no treatment as the negative control.Subsequently,the mRNA and protein expressions of K17 were measured by the above methods.Statistical analysis was done by the two-samplettest.ResultsThe mRNA expression of K17 was significantly higher in HaCaT cells treated with leptin alone than in those remaining untreated(3.086 7±0.186 1 vs.1.000 0±0.000 0,P＜0.01),but significantly downregulated in HaCaT cells treated with Piceatannol+leptin and those with PD-98059+leptin compared with those treated leptin alone(0.674 1±0.060 0 and 0.855 0±0.390 3 vs.2.242 7±0.188 7,bothP＜0.01).The results of Western blot and immunofluorescence staining were in agreement with those of real-time PCR.ConclusionsLeptin can induce K17 expression in HaCaT cells,likely by activating the STAT3 and Erk1/2 signaling pathways.

HaCaT cells;Leptin;Keratin-17

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.06.007

李承新,Email:chengxinderm@163.com