丹皮酚对人黑素瘤A375细胞增殖和凋亡的影响

陶玥 张孟丽 马鹏程 孙建方 周武庆 包军

丹皮酚对人黑素瘤A375细胞增殖和凋亡的影响

陶玥 张孟丽 马鹏程 孙建方 周武庆 包军

目的探讨丹皮酚对体外培养人黑素瘤A375细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法CCK8法检测0.5,1,2,4,8 mmol/L丹皮酚作用24,48和72 h后A375细胞增殖水平。用0、1.25、2.5和5 mmol/L浓度丹皮酚作用24 h后,以Annexin-V/PI法观察A375细胞凋亡的变化、分别测定caspase 3,caspase 8和caspase 9的活性,并以Western印迹检测p53,NF-κB及相关蛋白水平的变化。结果与空白对照组比较,0.5,1,2,4,8 mmol/L丹皮酚作用24,48和72 h后均对A375细胞的增殖有抑制作用,且与时间、浓度呈依赖性。1.25、2.5、5 mmol/L丹皮酚在作用24 h时,A375细胞早期凋亡率由对照组的(3.11±0.53)%分别上升至(13.74±1.73)%、(25.95±0.57)%、(46.44±0.81)%,各组与对照组间差异均有统计学意义(P＜0.05或＜0.01)。2.5 mmol/L和5 mmol/L作用组的caspase 3,caspase 8,caspase 9活性升高,且与对照组间比较,差异均有统计学意义(P＜0.05或＜0.01)。p53及Bax的蛋白水平随药物浓度的增加而升高,NF-κB、bcl-2、bcl-XL的蛋白水平随药物浓度增加而降低。结论丹皮酚对黑素瘤A375细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。可通过细胞内和细胞外两条途径发挥促凋亡作用,其机制可能与调节p53及NF-κB基因有关。

黑色素瘤,实验性;丹皮酚;细胞凋亡;细胞增殖

作者单位:210008南京市鼓楼医院皮肤科(陶玥、包军);中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所(张孟丽、马鹏程、孙建方、周武庆)

丹皮酚(paeonol)是从中药牡丹皮或徐长卿中提取的有效活性成分。已有大量研究表明,丹皮酚可诱导某些肿瘤细胞的凋亡,如肝癌,卵巢癌等[1-2],但对于黑素瘤细胞的促凋亡及其分子机制及其信号传导途径尚未见报道。本研究即以体外培养的人黑素瘤A375细胞为实验对象,通过测定半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)活性和p53、NF-κB等相关蛋白表达水平的变化,初步探讨药物诱导黑素瘤细胞凋亡的途径和调节机制。

材料与方法

一、材料

丹皮酚购于中国药品生物检定所(纯度＞99.0%);二甲基亚砜(DMSO)、1%抗生素/抗真菌溶液、Hoechst33258购于美国Sigma公司,胰酶、1640培养基购于德国Gibco公司,胎牛血清购于上海吉泰公司。CCK8试剂盒购于日本同仁化学公司,Annexin-V/PI凋亡检测试剂盒购于美国BD Pharmingen公司,caspase-Glo® 3/7,8,9检测试剂盒购于美国Promega公司。bcl-2抗体,bax抗体购于南京凯基生物科技发展有限公司,p53抗体,NFκB-p65抗体,bcl-XL抗体购于美国Santa Cruz公司。

二、方法

1.细胞培养:使用含10%胎牛血清的1640培养基,在37℃、5%CO2的孵箱中培养A375细胞,取对数生长期的细胞用于各项实验。

2.药物配制:药物溶解于DMSO,其终浓度分别为丹皮酚:0.5、1、2、4、8 mmol/L;DMSO 在培养基中的最大终浓度＜0.2%,经预实验证实对细胞增殖无影响。

3.CCK8检测细胞增殖抑制率:将对数生长期的A375细胞按1×104/孔分别接种于96孔板,在37℃、5%CO2下孵育24 h,去上清液,每孔加入一定浓度丹皮酚(0.5、1、2、4、8 mmol/L)的 1640 培养基100 μl,每一浓度设3个复孔,对照组直接加含有DMSO的1640培养基100 μl,空白孔只加含有DMSO的培养基,分别培养24、48、72 h后,以1640培养基小心洗涤细胞2次,每孔加入100 μl 1640培养基,再加入10 μl的CCK8溶液,在37℃、5%CO2下孵育2 h,在酶标仪450 nm波长下测量各孔吸光度值,细胞增殖抑制率=[1-(待筛物各浓度平均吸光度值-空白组平均吸光度值)/(对照组平均吸光度值-空白组平均吸光度值)]×100%。

4.丹皮酚对细胞凋亡率的影响[乙硫氰酸荧光素(Annexin V)-FITC/碘化丙锭(PI)双染法]:收集经 0、1.25、2.5、5 mmol/L 丹皮酚作用 24 h 后的A375细胞,预冷的PBS洗涤两遍,以1×连接缓冲液将细胞密度调整为1×106/ml,每管加Annexin V-FITC 5 μl、PI 5 μl,轻轻振荡混匀,室温避光染色15min,每管加400 μl 1×连接缓冲液,流式细胞仪检测细胞凋亡率。

5.caspase活性的测定:选择对数生长期的A375细胞,1640培养基调制成细胞悬液,以每孔100 μl、1×105/ml的密度接种在不透光的白底96孔培养板,在37℃、5%CO2下孵育24 h,去上清液,每孔加入一定浓度丹皮酚(1.25、2.5、5 mmol/L)的培养基100 μl,每个浓度设3个复孔,对照组直接加培养基,空白孔不加细胞只加培养基,作用24 h后,将10 μl GF-AFC与2 ml细胞活力测定缓冲液混合,每孔中加入20 μl混合液,充分摇匀后37℃避光孵育30min,测定细胞活力。接着每孔加入120 μl caspase-Glo®3/7,caspase-Glo®8或caspase-Glo®9试剂继续避光孵育30min,以荧光检测仪读数,除以细胞活力读数即为平均每个细胞的caspase活性值。

6.Western印迹检测p53,NF-κB及相关基因蛋白水平:参照文献[3],简述如下:将A375细胞分别与1.25、2.5、5 mmol/L丹皮酚的培养基2 ml作用24 h,提出相同质量的蛋白,进行凝胶电泳后将蛋白电转印到硝酸纤维膜上,以含5%的脱脂奶粉的TBST缓冲液室温封闭1 h,一抗(bcl-2抗体,bax抗体,p53抗体,NF-κB-p65抗体,bcl-XL抗体)4℃孵育过夜,继以二抗室温孵育1 h,化学发光法检测反应条带。对图像进行分析,以目的蛋白条带峰面积值占内参照蛋白条带峰面积值的百分比反映目的蛋白表达的结果。

7.数据处理:用SPSS 17.0统计软件进行统计分析,每组数据取平均值,结果以±s表示,组间比较用t检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、CCK8检测细胞增殖抑制率

与空白对照组比较,0.5、1、2、4、8 mmol/L 丹皮酚作用24、48、72 h均对A375细胞有抑制作用,且与时间、浓度呈依赖关系。随着药物浓度的增加和作用时间的延长,丹皮酚对A375细胞的生长抑制率逐渐增高(图1)。除作用24 h的0.5 mmol/L浓度组外,各组与对照组(增殖抑制率为0%)比较,差异有统计学意义(均P＜0.01)。丹皮酚处理A375细胞的24、48、72 h的半数抑制浓度(IC50) 分别约为5.19 mmol/L、1.50 mmol/L、1.09 mmol/L。

图1 丹皮酚对A375细胞增殖抑制率的影响

二、Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率1.25、2.5、5 mmol/L 丹皮酚在作用 24 h时,A375细胞早期凋亡率由对照组的(3.11±0.53)%分别上升至(13.74±1.73)%,(25.95±0.57)%和(46.44±0.81)%,各组与对照组间差异有统计学意义(均P＜0.05)。图2为一组具有代表性的A375细胞凋亡率检测结果。

图2 丹皮酚对A375细胞凋亡率影响的流式细胞图

三、caspase活性检测结果

如表1所示,1.25、2.5、5 mmol/L丹皮酚在作用24 h时,A375细胞的caspase 3,caspase 8和caspase 9活性均有不同程度的升高。其中caspase 3活性升高最为明显,分别为对照组的118.13%,167.85%和491.05%。2.5 mmol/L和5 mmol/L作用组的caspase 3,caspase 8,caspase 9活性与对照组间,差异有统计学意义(均P＜0.05)。

四、丹皮酚对p53及bax蛋白水平的影响

Western印迹法对1.25、2.5、5 mmol/L丹皮酚作用24 h后A375中的p53和bax进行检测。应用BandScan4.5图像分析软件,以β肌动蛋白的表达灰度值为标准,计算p53和bax的相对量。对照组、1.25、2.5、5 mmol/L组p53表达与β肌动蛋白的灰度比值分别为 0.66、1.10、1.19、1.49。 bax 表达与 β肌动蛋白的灰度比值分别为 0.74、1.10、1.19、1.49。可见,以未处理的A375细胞为对照,p53和bax在丹皮酚作用的黑素瘤细胞中的表达随药物浓度的增加而升高,见图3。

表1 丹皮酚对A375细胞caspase活性的影响(±s,%)

表1 丹皮酚对A375细胞caspase活性的影响(±s,%)

注:n=3。与对照组相比,a:P＜0.05,b:P＜0.01

浓度(mmol/L) caspase 3 caspase 8 caspase 9对照组 100.00±3.19 100.00±3.24 100.00±3.24丹皮酚1.25 118.13±4.02a 97.34±1.00 87.05±6.77 2.5 167.85±1.04b 121.94±3.83a 128.20±0.43b 5 491.05±0.55b 122.43±1.12a190.76±0.60b

五、丹皮酚对NF-κB及bcl-2、bcl-XL蛋白水平的影响

使用Western印迹法对1.25、2.5、5 mmol/L丹皮酚作用24 h后A375中的p65(NF-κB活性亚单位),bcl-2和bcl-XL进行检测。应用BandScan4.5图像分析软件,以β肌动蛋白的表达灰度值为标准,计算p65,bcl-2和bcl-XL的相对量。对照组、1.25、2.5、5 mmol/L组的p65表达与β肌动蛋白的灰度比值分别为 1.26、1.16、1.12、0.56;其 bcl-2 表达与 β 肌动蛋白的灰度比值分别为 0.68、0.74、0.54、0.25;其bcl-XL表达与β肌动蛋白的灰度比值分别为0.57、0.55、0.46、0.23。图4可见,以未处理A375细胞为对照,p65,bcl-2和bcl-XL在丹皮酚作用的A375细胞中的表达随药物浓度的增加而降低。

图3 丹皮酚对A375细胞p53和bax表达的影响 1:对照组;2:1.25 mmol/L;3:2.5 mmol/L;4:5 mmol/L

图4 丹皮酚对A375细胞p65,bcl-2和bcl-XL表达的影响1:对照组;2:1.25 mmol/L;3:2.5 mmol/L;4:5 mmol/L

讨 论

研究表明,丹皮酚具有广泛的药理活性,包括抗炎、解热镇痛、抗动脉粥样硬化、抑制血小板聚集、抗氧化等作用[4]。我们的研究还发现丹皮酚可以抑制黑素细胞黑素的生成[5]。近年来,从天然植物中筛选抗肿瘤成分一直是国内外抗肿瘤药物研究的热点,丹皮酚的诱导肿瘤细胞凋亡的作用也越来越引起学者们的注意。本研究结果表明:丹皮酚能抑制皮肤黑素瘤A375细胞的增殖活性,诱导细胞凋亡,且这种作用随着药物浓度的升高和作用时间的增加而逐渐增强,具有浓度和时间依赖性。

诱导细胞凋亡主要有caspase依赖途径和非caspase依赖途径,而以前者为主[6]。caspase家族被认为是细胞凋亡的中心环节。目前认为至少有3条通路参与凋亡的发生,包括经典的两条细胞凋亡途径:细胞外途径(细胞表面死亡受体途径)和细胞内途径(线粒体引发途径),以及新近引起关注的内质网通路[7]。其中,在细胞外途径中,细胞膜表面的TNF家族受体(Fas)接受外源性刺激信号后,通过胞质中的蛋白网络传至上游的启动因子caspase 8,激活启动凋亡程序[8]。在细胞内途径中,线粒体接受细胞内的死亡信号,如DNA损伤等有害刺激时释放细胞色素C,细胞色素C可与Apaf-1结合并使之活化,活化的Apaf-1可结合并激活caspase 9,导致内源性细胞凋亡过程的启动[9]。活化的caspase 8和caspase 9裂解后可激活下游众多的caspase。下游的蛋白酶级联反应是外源和内源途径的共同途径,主要的效应分子是caspase 3。我们通过对caspase活性测定,检测3种重要的凋亡相关蛋白激酶caspase 3,caspase 8和caspase 9在丹皮酚作用于A375细胞时的活性变化。结果显示以1.25、2.5、5 mmol/L的丹皮酚作用A375细胞24 h后,3种蛋白酶的活性均呈浓度依赖性增加,提示丹皮酚可通过细胞内和细胞外两种途径诱导A375细胞凋亡。

NF-κB和p53在调控细胞凋亡过程中起重要作用。在肿瘤的发生发展过程中,NF-κB调控一系列与细胞的存活、增殖、侵袭和转移等相关的基因的转录,参与肿瘤的增殖、侵袭和转移等各个环节,被认为是肿瘤发生的最重要原癌基因之一,抗肿瘤治疗的重要靶点[10]。p53则是第一个被确认与DNA损伤引起的凋亡有关的蛋白。活化的p53可以转录激活一系列凋亡效应分子,通过细胞内或细胞外途径诱导凋亡。bcl-2基因家族是细胞凋亡的重要调节者。根据其对细胞凋亡作用的功能特点,可将bcl-2蛋白家族分为两类:促凋亡蛋白家族如bax、bak、bad、bid、bim 和抗凋亡蛋白家族, 如 bcl-2、bcl-XL、bcl-w、Mcl-1。NF-κB激活后可通过增加抗凋亡蛋白如bcl-2、bcl-XL等基因的编码转录,从而发挥抗凋亡作用[11]。p53也可以直接转录激活隶属于bcl-2家族的基因如促凋亡蛋白bax,进而促进细胞凋亡[12]。

用Western印迹测定丹皮酚作用的A375细胞中 p53、NF-κB 及其下游基因 bax,bcl-2、bcl-XL 的蛋白水平变化,结果示p53及其下游基因bax的蛋白表达随丹皮酚浓度的增加而增强,而p65(NF-κB的主要活性单位)和其下游基因bcl-2、bcl-XL的蛋白水平则因丹皮酚的作用逐渐降低。可见,丹皮酚通过下调NF-κB和激活p53诱导黑素瘤A375细胞的凋亡。同时,丹皮酚也通过调节bcl-2家族,尤其是降低bcl-2与bax的比值诱导细胞凋亡。

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2013-11-26)

(本文编辑:吴晓初)

Effects of paeonol on the proliferation and apoptosis of A375 human melanoma cells

Tao Yue*,Zhang Mengli,Ma Pengcheng,Sun Jianfang,Zhou Wuqing,Bao Jun.*Department of Dermatology,Nanjing Drum Tower Hospital,Nanjing 210008,China

s:Ma Pengcheng,Email:mpc815@163.com;Sun Jianfang,Email:fangmin5758@aliyun.com

ObjectiveTo study the effect of paeonol on the proliferation and apoptosis of A375 human melanoma cells and its mechanism.MethodsCell counting kit-8(CCK8)was used to evaluate the proliferative activity of A375 cells treated with paeonol of 0.5,1,2,4,8 mmol/L for 24,48 and 72 hours respectively.Subsequently,A375 cells were treated with paeonol of 1.25,2.5 and 5 mmol/L for 24 hours followed by double staining with annexin V and propidium iodide for the detection of cell apoptosis,fluorometric assay for the estimation of caspase 3,caspase 8 and caspase 9 activity,and Western blot for the determination of the levels of p53,nuclear factor-κB proteins and some of their target proteins.The A375 cells receiving no treatment served as the blank control group.Statistical analysis was carried out byttest.ResultsWithin the investigated concentration and time ranges,paeonol significantly inhibited the proliferative activity of A375 cells in a concentration-and timedependent manner.Compared with the blank control group,a significant increase was observed in the early apoptosis rate in A375 cells treated with paeonol of 1.25,2.5 and 5 mmol/L for 24 hours(13.74%±1.73%,25.95%±0.57%and 46.44%±0.81%vs.3.11%±0.53%,P＜0.05 or 0.01),as well as in the activity of caspase 3,8 and 9 in A375 cells treated with paeonol of 2.5 and 5 mmol/L for 24 hours(P＜0.05 or 0.01).After 24-hour treatment,the protein levels of p53 and Bax were elevated,but those of nuclear factor-κB,Bcl-2 and Bcl-XL were decreased in A375 cells with the increase of paeonol concentration.ConclusionsPaeonol can inhibit the proliferation but induce the apoptosis of A375 cells,and the apoptosis-inducing effect may be realized through intrinsic and extrinsic pathways by modulating nuclear factor-κB and p53 genes.

Melanoma,experimental;Paeonol;Apoptosis;Cell proliferation

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.06.005

马鹏程,Email:mpc815@163.com;孙建方,Email:fangmin5758@aliyun.com