冠心病合并颈动脉斑块痰瘀互结气郁证患者PLT-WBC相关参数的改变

刘小瑗，范金茹*，王美香，陈学娟，熊 杜，王建湘

（1.湖南中医药大学研究生教育学院，湖南 长沙410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007）

动脉粥样硬化（Arteriosclerosis，AS）是冠心病与颈动脉斑块的共同生理病理基础，通过颈动脉斑块的形态及面积的检测，可以预测冠脉病变及心血管事件的发生。本研究通过检测血小板-白细胞（PLTWBC）相关参数，探讨其在冠心病合并颈动脉斑块痰瘀互结气郁证发病中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

将2013年6月至2014年5月于湖南中医药大学第一附属医院心内科病房、心血管门诊就诊的冠心病合并颈动脉斑块患者90 例， 按照中医证候诊断标准分别纳入痰瘀互结气郁证组 （观察组）60例、非痰瘀互结气郁证组（对照组）30 例，体检科健康成年人30 例纳入健康组。 3 组的年龄、性别差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。

表1 3 组患者一般资料比较

1.2 西医诊断标准

参照《慢性稳定性心绞痛诊断与治疗指南》[1]及《中华人民共和国卫生部行业标准—冠状动脉粥样硬化性心脏病诊断标准》[2]， 加拿大心脏病学会（CCS）心绞痛分级标准[1]，颈动脉内中膜厚度（IMT）以最厚颈总动脉IMT 为比较变量，将IMT≥1.2 mm定义为粥样硬化斑块形成[3-4]。

1.3 中医诊断标准

1.3.1 胸痹心痛合并眩晕诊断标准 参照《实用中医心病学》[5]及《中药新药临床研究指导原则》[6]相关标准。

1.3.2 中医证候诊断标准 参照 《实用中医心病学》[5]及《中药新药临床研究指导原则》[6]，胸痹心痛分为：心血瘀阻型、气虚血瘀型、气滞血瘀型、痰阻心脉型、阴寒凝滞型、气阴两虚型、心肾阴虚型、阳气虚衰型。 以上8个证型凡具有胸痛、胸闷主症之一，其他症具有2 项及舌脉支持者，即可诊断。 （1）主症：①胸痛、胸闷—胸部刺痛、胀痛或绞痛，固定不移，入夜更甚，或痛引肩背或臂内侧，胸胁胀闷或胸闷如窒而痛； ②头晕目眩； ③气滞—胸胁不舒，时轻时重，常随情志改变，情绪不宁，善太息；④多痰表现：口吐痰涎，咽中痰阻，体胖、肢体困重、体质量指数＞25。 （2）次症：①口唇紫绀，舌质紫暗或见瘀斑瘀点，苔腻或滑，舌下系带迂、紫暗或有瘀点瘀斑； ②心悸不宁；③活动后气促；④失眠健忘；⑤脉细涩或滑或弦。 具备主症①、②、④项及以上，次症具有⑤项及其他任何两项以上，可诊断为痰瘀互结气郁证。

1.4 纳入标准

1.4.1 患者标准 符合中、西医诊断标准的稳定型心绞痛Ⅲ级合并颈动脉斑块患者，年龄在40～75 岁之间。

1.4.2 健康人标准 （1）60 岁以上入选者参照中华医学会老年医学分会2013 提出的《中国健康老年人标准》[7]，60 岁以下入选者参照世界卫生组织1989年对健康作出的定义；（2）无已有文献报道的可对P-选择素（PS）等指标表达有影响的疾病；（3）年龄40～75岁。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 酶联免疫吸附法 所有入选病例，于清晨空腹抽取静脉血4 mL 于抗凝管中， 以3 000 r/min的速度离心15 min。 取上清液，于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。 严格按照试剂盒（武汉贝茵莱生物科技有限公司，批号：201402）说明书要求操作，检测血浆P 选择素（PS）、P 选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)、WBC 分化抗原40(CD40)、WBC 分化抗原40配体(CD40L)水平。

1.5.2 流式细胞术 所有入选病例， 于清晨空腹抽取静脉血4 mL 于抗凝管中， 分别取两支空白流式管， 标记为管①及管②， 在两支流式管中分别加入10 mL 全血。于管①中加入2 μL CD45、4 μL CD40、4 μL CD162 及4 μL CD154； 于管②中加入2 μL CD45、4 μL CD40、4 μL CD62P、4 μL CD41a 及4 μL CD154。 避光孵育20～30 min 后分别在两管中加入BPS 缓冲液300 μL，上流式细胞仪检测。所有流式细胞术试剂均采用美国BD 公司生产的试剂。

1.6 统计学分析

采用SPSS 19.0 统计软件分析。 计数资料以率或构成比表示，采用卡方检验或秩和检验；计量资料进行正态分布和方差齐性检验，以“±s”表示， t检验，不满足正态性分布及方差齐性者采用非参数检验。 所有数据均采用双侧检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组患者血浆PS、PSGL-1、CD40、CD40L 比较

观察组、对照组血浆PS、PSGL-1、CD40、CD40L水平均明显高于健康组（P＜0.01），且观察组高于对照组（P＜0.01），见表2。

表2 3 组患者血浆PS、PSGL-1、CD40、CD40L 比较 （±s）

表2 3 组患者血浆PS、PSGL-1、CD40、CD40L 比较 （±s）

注：与健康组比较**P＜0.01；与对照组比较##P＜0.01。

组 别观察组对照组健康组n 60 30 30 PS(ng/L)30.28±6.11**##22.47±7.39**7.83±3.39 PSGL-1(pg/mL) CD40(ng/L) CD40L(ng/L)3 013.54±320.72**## 68.58±6.13**## 713.71±65.86**##2 671.14±294.05** 53.93±4.19** 651.54±58.21**1 231.38±142.83 35.79±3.88 375.15±28.59

2.2 3 组患者血细胞PS、PSGL-1、CD40、CD40L 比较

观察组、 对照组血细胞PS、PSGL-1 水平及WBC、PLT 上CD40、CD40L 水平均明显高于健康组（P＜0.01），且观察组高于对照组（P＜0.05），见表3。

表3 3 组患者血细胞PS、PSGL-1、CD40、CD40L 比较 （±s，%）

表3 3 组患者血细胞PS、PSGL-1、CD40、CD40L 比较 （±s，%）

注：与健康组比较**P＜0.01；与对照组比较#P＜0.05。

组 别观察组对照组健康组n 60 30 30 PS 41.78±15.32**#28.25±13.01**3.68±1.42 CD40 CD40L WBC PLT WBC PLT 87.36±5.39**# 1.46±0.51**# 2.39±0.48**# 1.38±0.45**# 1.05±0.62**#72.75±3.53** 1.15±0.42** 1.94±0.62** 1.02±0.39** 0.81±0.49**64.75±3.53 0.20±0.19 0.32±0.11 0.23±0.28 0.10±0.04 PSGL-1

3 讨论

PLT-WBC 相互反应主要涉及两对蛋白，即PS/PSGL-1、CD40/CD40L。 PLT-WBC 相互反应促使血小板、白细胞相互聚集、活化，并释放炎性递质，参与炎症反应，继而与斑块的形成、破裂及血栓的形成密切相关。 痰、瘀作为胸痹心痛的主要病理因素，与西医冠心病的斑块、血栓形成有共同点。 结果显示，观察组PS/PSGL-1、CD40/CD40L 的表达明显高于健康组，说明PS/PSGL-1、CD40/CD40L 水平的升高， 在冠心病合并颈动脉斑块发病中有临床意义，可用于评价PLT-WBC 相互反应的程度； 观察组均为痰瘀互结气郁证患者， 其PLT-WBC 相关参数均高于非痰瘀互结气郁证的对照组， 因此可以推测PLT-WBC 相关参数与痰瘀互结气郁证可能存在一定关联。

体外试验显示[8]，PS 的增加并不会随着时间的延长而发生逆转，因此PS 被认为是血小板活化的“金标准”。 在血栓性疾病中，通常只有小部分的血小板被活化；凝血酶体外活化血小板，也常表现为亚群激活； 活化的血小板表达CD62 等膜糖蛋白也有明显的异质性[9]。 而有研究表明[10]，PS 不断从外周血血小板上脱落进入血浆， 随着血小板保存时间的延长，血浆内可溶性PS 浓度升高，这可能是解释可溶性PS 与血小板体内存活期相关性差的理由之一。

CD40L 作为主要表达于活化的T 细胞血小板上的跨膜蛋白，它也以可溶性的形式从细胞上脱落进入血循环。研究结果显示[11]，血小板活化后可释放微泡， 血小板微泡是循环血中CD40L 的来源之一，在诱发炎症反应后微泡上有CD40L 表达。通过高速离心将可溶性CD40L 和与囊泡结合的CD40L 分开，酶联免疫法虽然可检测微泡上的CD40L，但仅能观察炎症反应发生后其浓度增加的发展趋势。 而流式细胞术不但可明确CD40L 的来源，而且在检测CD40L 的表达上更为精准。

本次研究通过对同指标不同检测方法的对比看出， 流式细胞术的检测比酶联免疫法更加精确。且血小板作为血栓形成的重要来源， 极易活化，循环中的红细胞、白细胞对其活化均有影响。 抗凝剂的选择、离心、标本处理不当等都有可能导致医源性血小板激活从而影响诊断价值。 流式细胞术因其标本处理的简化、直接标记血细胞从而不受其他种类细胞或碎片的干扰、 能灵敏地检测少到1%活化血小板亚群使得检测结果更加真实等优点，已成为灵敏、准确、快速且能运用于临床常规检测血小板膜糖蛋白的表达，评价血小板功能的首选方法。

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