脾虚证慢传输型便秘小鼠模型构建方法的比较研究

夏旭婷，樊俊阳，王碧玉，胡 政，喻长红，李 霞，刘富林*

（湖南中医药大学，湖南 长沙410208）

慢传输型便秘(Slow transit constipation，STC)是常见的消化系统功能性疾病， 系结肠传输功能障碍，内容物滞留于结肠或结肠通过缓慢引起的顽固性便秘。 因其发病机制不明，极大影响了临床诊疗。辨证论治是中医学的特点之一，病症结合的脾虚证STC 小鼠模型是研究脾虚证STC 病理生理的基础。目前STC 小鼠模型大多以盐酸哌洛丁胺造模[1]，而脾虚证STC 小鼠模型主要采用番泻叶+限水+控制饮食、游泳结合饥饱失常等复合因素造模。 本实验从3 种不同的STC 小鼠模型中优化脾虚证STC 模型的建立。 现将方法和结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物和分组 SPF 级昆明小鼠80 只， 雄性，体质量(29.0±1.8)g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司， 实验动物许可证号：SCXK (湘)2013-0004。 将小鼠分笼饲养，保持适宜的环境(室温23～25 ℃，相对湿度50%～70%，清洁安静)，适应性喂养7 d 后随机分成4 组：正常组、模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，每组20 只（其中10 只做排便实验，10 只做肠道推进率和血清D-木糖含量检测）。

1.1.2 药物及试剂 番泻叶（湖南中医药大学第一附属医院，批号：20140225）；盐酸洛哌丁胺胶囊（西安杨森制药有限公司，批号：131120657）；印度墨水（北京诺博莱德科技有限公司）；D-木糖试剂盒 （南京建成生物工程研究所，批号：20140320）。

1.1.3 主要仪器 XSP-10C 生物显微镜，上海光学仪器厂；TG16-WS 台式高速离心机 （长沙湘仪离心机仪器有限公司）；UV-1800 紫外可见分光光度计（长沙市八方科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 药物制备 （1）番泻叶浸泡液的制备 取番泻叶500 g，加10 倍量沸水浸泡10 min，滤过，将滤液在旋转蒸发器中浓缩成浓度为l g/mL 的水煎液放入玻璃瓶中，编号、冷藏、备用。 （2）盐酸洛哌丁胺混悬液的制备 将盐酸洛哌丁胺胶囊以研钵研磨至极细粉末， 按成人1日最大量折算成小鼠的用量， 用蒸馏水调配成浓度为0.2 g/mL 的混悬液，编号、冷藏、备用。

1.2.2 模型制备 模型Ⅰ（番泻叶组）[2]：第1 天～第7天，番泻叶按20 g/（kg·d）计算，灌胃，正常饮食饮水，第8 天起停用番泻叶，隔天喂生大米4～8 g，隔天饮水1 次，每次0.5 h，造模共15 d。模型Ⅱ（游泳组）[3]：隔天进食普通饲料致饥饱失常，每天游泳2 次，每次10～20 min 致过度疲劳，连续12 d，从第13 d 开始禁水，以大米喂养3 d，造模共15 d。 模型Ⅲ（哌洛丁胺组）[4]： 连续7 d 按体质量0.2 mL/10 g 灌盐酸哌洛丁胺混悬液， 造模共7 d。 空白组小鼠按0.2 mL/10 g 灌蒸馏水。

1.3 评价方法

1.3.1 一般行为学特征 每天观察并记录小鼠的活动度、精神状况、毛发光泽度及排便情况，每3 d称体质量1 次。

1.3.2 排便实验观察 每组随机取10 只小鼠均禁食不禁水24 h，经口灌入印度墨水0.2 mL/只，从灌胃完毕开始记时，记录每只小鼠从灌胃到首粒黑便排出的时间，连续观察6 h，记录6 h 总排便粒数并称质量。

1.3.3 血清D-木糖含量检测 每组剩余的10 只小鼠均禁食不禁水24 h。 按10 mL/(kg·d)剂量给予小鼠3% D-木糖溶液灌服， 麻醉l h 后眼球取血，血液静置2 h 后，3 500 r/min 离心15 min 制备血清，按照D-木糖试剂盒说明书所述，应用紫外可见分光光度计测定各组小鼠血清D-木糖含量。

1.3.4 肠道推进率检测 灌完D-木糖液的小鼠40 min 后经口灌入印度墨汁0.2 mL，20 min 眼球取完血后立即剖腹取出幽门到直肠末段的全部肠道，生理盐水冲洗后，无张力状况下测量肠道全长及墨汁推进长度，计算墨汁推进长度占肠道全长的百分比(黑染肠管长度/肠管总长度×%)。

1.3.5 结肠黏膜病理检测 取约2 cm 结肠组织放入4%甲醛液中固定，常规脱水，石蜡包埋，制成厚度为0.4 μm 组织切片，HE 染色， 在光学显微镜下观察结肠黏膜组织病理改变。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 一般行为学特征比较

正常组小鼠外观丰满，反应灵敏，活动迅速，背毛浓密有光泽，饮食、饮水适中，大便成形，质软，量一般，体质量增加。 造模成功后3 组小鼠外观干瘪、瘦小、皮肉松弛，竖毛、毛质粗糙色深，拱背、活动减少，反应迟钝，体质量减轻，粪便干结、质硬，数量减少，颗粒细小。 模型Ⅲ较模型Ⅰ、Ⅱ组小鼠变化程度轻，体质量先轻度下降，后又成增长趋势。

2.2 各组小鼠排便情况比较

与正常组相比，3 种模型小鼠首粒黑便传出时间均显著延长(P＜0.01)； 且模型Ⅰ组显著长于模型Ⅱ、Ⅲ组(P＜0.01) 。 6 h 排便数量和质量模型Ⅰ、Ⅲ组均较正常组减少(P＜0.05 或P＜0.01)；与模型Ⅰ组比较，模型Ⅱ、Ⅲ组差异显著(P＜0.05 或P＜0.01)；而模型Ⅱ组与正常组比较差异无统计学意义 （P＞0.05）。 结果见表1。

2.3 各组小鼠肠道推进率及血清D-木糖含量检测比较

与正常组相比，各模型组小鼠肠道推进率都有降低的趋势，但差异均无统计学意义（P＞0.05）；血清D-木糖含量模型Ⅰ、 Ⅱ组与正常组相比显著降低（P＜0.01）， 模型Ⅰ与模型Ⅱ组间比较无差异 (P＞0.05)，但均低于模型Ⅲ组（P＜0.01）。 结果见表2。

表1 各组小鼠排便情况比较 （±s，n=10）

表1 各组小鼠排便情况比较 （±s，n=10）

注：与正常组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与模型Ⅰ比较△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型Ⅲ比较▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。 下表同。

组 别正常组模型Ⅰ模型Ⅱ模型Ⅲ首粒黑便排出时间（min）134.00±34.62 331.25±23.41**218.13±26.31**△△▲281.25±40.86**△△6 h 排便数量（粒）15.30±1.34 2.00±1.00**13.89±1.27△△▲▲4.78±1.00**△△6 h 排便质量（g）0.56±0.24 0.02±0.12**0.52±0.12△△▲0.48±0.16*△

表2 各组小鼠肠道推进率及血清D-木糖含量比较（±s，n=10）

表2 各组小鼠肠道推进率及血清D-木糖含量比较（±s，n=10）

组 别正常组模型Ⅰ模型Ⅱ模型Ⅲ肠道推进率（%） 血清D-木糖（mmol/L）78.27±7.09 0.43±0.12 71.56±8.97 0.14±0.09**▲▲76.64±7.18 0.20±0.06**▲▲73.93±8.98 0.42±0.05

2.4 结肠黏膜病理检测

正常组小鼠结肠黏膜未发现黏膜层、肌层及肌间神经丛的病变；模型Ⅰ组小鼠可见轻度结肠黏膜炎症改变，整个肌层包括平滑肌细胞及肌间丛神经节细胞等未见明显细胞变性及坏死；模型Ⅱ组小鼠结肠黏膜未发现黏膜层、 肌层及肌间神经丛的病变；模型Ⅲ组结肠黏膜呈轻度炎症改变。 结果见封三彩图图1 所示。

3 讨论

随着生活节奏的加快、饮食结构的改变以及精神心理因素的影响，便秘的患病率日益增加，且有随年龄增长而升高的趋势，严重影响了人们的生活质量[5]。 中医学认为脾主运化，为气血生化之源，若脾胃受损，气血生成不足、运行不畅，气机阻滞，影响饮食物的消化吸收及粪便的形成、传输，故脾虚证是STC 常见的中医证型[6]。 西晋《脉经》卷二有“脾虚，……病苦泄注，腹满，气逆。 ”明·缪希雍《本草经疏》论述“脾虚十二证，饮食劳倦，伤脾发热”，可见久泄、饮食不节、劳倦过度均可致脾虚，因此，本实验选取的模型Ⅰ与模型Ⅱ以 “久泄致虚”“疲劳致虚”及“饮食不节损伤脾胃”的中医学理论为指导，建立脾虚型STC 模型。 其中，模型Ⅰ用番泻叶+限水法+控制饮食造模， 既符合便秘患者服用泻剂的病理过程，又可因控制饮食减慢肠道蠕动。 模型Ⅱ采用游泳结合饥饱失常法造模， 因游泳致疲致虚，饥饱失常致肠道运动失司， 影响粪便的形成和传输，水的摄入减少又可使肠道蠕动减慢。 模型Ⅲ为以盐酸洛哌丁胺混悬液造模，洛哌丁胺为阿托品受体激动剂，能激动肠壁阿片受体，阻止乙酰胆碱和前列腺素释放，拮抗平滑肌收缩，减少肠蠕动和分泌。 本实验所选取的3个模型都具有理论及实践依据。

该实验通过比较发现3 种模型小鼠粪便干硬，数量减少，颗粒细小，首粒黑便排出时间显著延长。其中，模型Ⅰ、Ⅲ组小鼠6 h 排便数量和质量减少，而模型Ⅱ组与正常组比较差异不明显，可能是游泳在造成脾虚的同时，使肠道蠕动加快，再者，虽然结合饥饱失常及限水法， 小鼠在造模期排便减少，但在禁食不禁水的检测过程中，因水的刺激导致小鼠肠道刺激性蠕动加快，排便短暂性增多。 模型Ⅰ、Ⅲ组小鼠表现为便秘，尤其以模型Ⅰ组小鼠便秘程度为重，其肠道传输功能明显减弱。 血清D-木糖含量是反映消化吸收功能较为敏感和特异的检测指标，现已是验证脾虚的经典指标[7]。 模型Ⅰ、Ⅱ组小鼠血清D-木糖含量显著降低，外观干瘪、瘦小、竖毛、拱背、活动减少，反应迟钝，体质量减轻，表明小肠吸收功能减弱，符合脾虚的表现。3 种模型小鼠结肠黏膜均符合功能性疾病的病理表现，模型Ⅰ、Ⅲ组结肠黏膜呈炎症改变，研究[8]认为是因为结肠蠕动减慢，大便在肠道存留时间延长，肠内细菌繁殖并分解产生大量的有害物质如吲哚酚类色氨酸代谢产物等致结肠黏膜肠神经系统损害。

值得一提的是本实验3 种模型小鼠肠道推进率都有降低的趋势，但差异无统计学意义。 这与以往的文献报道有差别。 究其原因，可能是墨汁在胃肠道的传输过程是经过胃、小肠后才到结肠，胃及小肠对墨汁运行速度影响较大， 而STC 病位在结肠，若胃排空或小肠蠕动加快，即使结肠蠕动减慢，仍会造成肠道推进率下降不明显甚至加快的结果。因此，肠道推进率无法完全反映出结肠“慢传输”的特点。

综上分析，模型Ⅰ（番泻叶+限水法+控制饮食模型）值得作为研究脾虚证STC 的动物模型。 因其具有肠道传输明显减慢、排便量减少、排便难、粪质干硬的特点，与便秘临床症状相似，首粒黑便传出时间明显延长、6 h 排便数量和粪便质量明显减少、血清D-木糖值显著降低、 结肠黏膜无器质性病变，更符合临床上脾虚型慢传输型便秘的客观标准。 通过本研究，认为脾虚证STC 小鼠模型的评价指标可包括：（1）动物的体征、行为表现，如外观、精神状态、体质量及粪便的数量、质地、颗粒大小等；（2）与证候相关的理化指标，如D-木糖代谢率等；（3）与临床相似的检查指标，如首粒黑便传出时间、6 h 排便数量和质量等；（4）组织病理学检测，用以排除器质性病变；（5） 从中医病因学角度推测并认定证候属性，如“疲劳致虚”、“久泄致虚”；（6）以方测证，治疗性诊断，选择临床上疗效确切的治疗特定证候的经典方剂及药物分析对模型动物的影响，佐证证候属性。

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