miRNA－21在结直肠癌中的表达研究

邱 实，孟凡旭，刘 念，刘林林

（吉林大学第二医院 放疗科，吉林 长春130041）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是胃肠道中常见的恶性肿瘤，随着近些年我国人口老龄化加剧、饮食习惯和生活方式的改变，结直肠癌的发病率和死亡率较前明显上升[1]。结直肠癌的早期筛查与诊断越来越受人们的关注。microRNA（miRNA）是由Lee等于1993年发现的一类新的长度为19－25的内源性非编码RNA分子，参与了发育、细胞增殖、分化及凋亡等一系列重要生命过程。近些年研究发现，在肿瘤发生发展过程中miRNA发挥类似抑癌基因和癌基因的作用，影响肿瘤的发生、发展[2]。本次研究应用实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测miRNA－21在正常人和结直肠癌患者血清，以及结直肠癌患者癌组织和癌旁组织中的表达，分析miRNA－21表达水平与结直肠癌临床病理参数的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2012年5月——2012年8月于吉大三院行手术治疗的42例经病理诊断为结直肠癌的患者为研究对象，术前未行放化疗。患者年龄52岁－74岁，中位年龄62岁，男26例，女16例，按照美国癌症联合委员会（AJCC）／国际抗癌联盟（UICC）结直肠癌TNM分期系统（2010年第七版）进行TNM分期。取肿瘤组织及癌旁组织（取材部位距离肿瘤边缘至少5cm的正常肠黏膜组织），离体10min内放入液氮保存；抽取患者术前及术后血液，保存于超低温冰箱。抽取同期16例健康人血液，年龄49岁－76岁，中位年龄61岁，其中男10例，女6例。

1.2 试剂及仪器

Trizol试剂（Takara公司）、DEPC 水（Takara公司）、miRNA isolation提取分离试剂盒（Takara公司）、MMLV Reverse Transcriptase（Takara公司）、Hairpin－itTM miRNAs RT－PCR Quantitation Kit试剂盒（苏州吉玛基因股份有限公司）、引物hsmiRNA－21及内参U6均购自苏州吉玛基因股份有限公司；ABI－7300实时荧光定量仪（美国ABI公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 RNA提取 取3－5ml血液样本加入红细胞裂解液至10ml，3 000r／min离心10min，弃上清，沉淀中加入1ml Trizol，按照miRNA isolationg提取分离试剂盒说明书中的步骤提取miRNA。

取液氮保存组织样本约500mg，研磨后加入1 ml Trizol，然后按照miRNA isolationg提取分离试剂盒说明书中的步骤提取miRNA。

使用紫外分光光度仪测定提取RNA的浓度及纯度，其 A260／A280比值应在1.8－2.1之间，计算RNA浓度用于进一步实验。

1.3.2 RNA的逆转录 取3μg模版RNA，加入4 μl 5×MMLV RT Buffer、0.75μl dNTP（10mM）、1.20μl MiR－RT primers（1μM）、0.25μl Rnasin（40U／μl）及0.2μl MMLV Reverse Transcriptase（200U／μl），RNase－free water将总体系补至20μl构成逆转录反应体系。使用普通PCR仪将提取的总RNA逆转录成cDNA。反应条件：25℃30min，42℃30min，85℃5min。

1.3.3 RT－qPCR 血清样本和组织样本逆转录得到的cDNA 为模版，按照 Hairpin－itTMmiRNAs RT－PCR Quantitation Kit试剂盒说明书加入相关试剂及引物，以U6为内参，在ABI－7300实时荧光定量仪上进行PCR扩增。反应条件：95℃3min预热，然后95℃12s、62℃40s共40个循环。

1.4 数据分析

本试验采用2－ΔΔCt法进行表达量分析。反应体系中荧光信号达到阈值的循环数为Ct，ΔΔCt＝（Ct实验组目的基因－ Ct实验组管家基因）－ （Ct对照组目的基因－Ct对照组管家基因），计算ΔΔCt后再计算2－ΔΔCt值，2－ΔΔCt为miRNA的相对表达比率。

使用SPSS 12.0统计软件，计算资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，P≤0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

miRNA－21在结直肠癌患者血清（3.64±0.31）中表达明显高于正常人血清（1.02±0.12）（P＜0.05），miRNA－21在结直肠癌组织（7.17±1.46）中表达水平明显高于癌旁组织（2.33±0.84）（P＜0.05），中晚期（Ⅲ期和Ⅳ期）结直肠癌组织（7.25±0.76）中表达水平明显高于早期（Ⅰ期和Ⅱ期）结直肠癌（3.25±0.24）（P＜0.05）；低分化肿瘤组织（7.18±1.08）中miRNA－21表达水平明显高于中高分化者（3.31±0.68）；有淋巴结转移的结直肠癌组织（7.16±1.14）中miRNA－21表达水平明显高于无淋巴结转移者（3.47±0.84）（见表1）。且发现结直肠癌患者血清中 miRNA－21的表达与癌组织中的miRMA－21表达间存在秩相关关系（见图1）。

表1 miRNA－21表达水平与结直肠癌临床病理参数的关系

3 讨论

图1 miRNA－21在结直肠癌患者血清中与癌组织中相对表达率关系

大量研究表明，miRNA参与胚胎发育、细胞周期调控、细胞分化增殖与凋亡等重要的生命进程[3]。随着分子生物学技术的不断发展及研究的深入，对miRNA的认识也越来越深刻。其通过识别结合靶mRNA从而影响靶mRNA的降解或翻译来调节靶基因的表达[4]。生物信息学分析发现，尽管miRNAs仅构成人类基因组的1%－3%，但多达30% 的人类基因可能被miRNAs所调节[5]。有50%以上的miRNA基因位于肿瘤相关基因组区域内，多种miRNA在人类肿瘤中都存在异常表达，如结直肠癌中 miRNA－145表达下调[6]、胰腺癌中 miRNA－21表达上调[7]、胃癌中的 miRNA－155 表达上调[8]等。提示miRNA可能发挥类似癌基因及抑癌基因的作用，在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用[9]。miRNA－21是在人类组织中发现较早、研究比较多的miRNA，现已发现在胃癌、胰腺癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤组织中存在明显的上调，因此认为其在肿瘤发生过程中发挥类癌基因作用。目前已证实miRNA通过作用于 P53、Bcl－2、PTEN 等靶基因，参与肿瘤生长、转移，与肿瘤侵袭及耐药等密切相关[10－12]。

本次研究采用RT－qPCR技术检测了正常人和结直肠癌患者血清，以及结直肠癌患者癌组织和癌旁组织中的表达，结果显示结直肠癌患者miRNA－21表达水平与性别、年龄无明显相关性，结直肠癌患者血清中miRNA－21表达水平显著高于正常人血清（P＜0.05）；结直肠癌组织中 miRNA－21表达水平明显高于癌旁组织；而且miRNA－21的表达与TNM分期有关，TNM分期越晚，其表达水平越高，在淋巴结转移阳性的结直肠癌中表达明显增高，其表达水平还与分化程度相关，低分化肿瘤组织中miRNA－21表达水平明显高于中高分化者。同时还发现结直肠癌患者血清中miRNA－21的表达与癌组织中的miRMA－21表达间存在秩相关关系，但未能观察到结直肠癌血清与癌组织中miRNA－21的相对定量之间的线性相关关系，这可能与样本量较小有关，有待于更大样本的研究。

本实验入组的42例患者均行CEA及CA－199检测，大部分在正常范围内，仅有4例明显高于正常范围，但其血清miRNA－21的相对定量明显高于正常人的平均值。且在本实验中我们观察到结直肠癌血清与癌组织中miRNA－21的相对定量之间的相关性，这使得miRNA－21i的血液检测成为可能。但血清miRNA－21的检测是否比传统的肿瘤标记物具有更高的灵敏性及特异性，有待进一步大样本的临床研究。

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