基于shotgun技术对鹿茸蛋白质组学的初步分析

魏征人，陈智嘉，刘 洋，赵 静，于 鸿，吴 荻2，＊

（1.吉林大学白求恩医学部基础医学院药理学教研室，吉林 长春130021；2.吉林大学第一医院肿瘤中心；

3.吉林省肿瘤医院；4.吉林大学人兽共患病研究所人兽共患病研究教育部重点实验室）

鹿茸是中国传统的名贵中药材，它是雄鹿鹿角成熟前未骨化、密生绒毛的幼角。具有促生长代谢、抗炎、免疫调节、抗衰老、促进伤口愈合及组织修复等多种药理作用[1]。吉林省长春市双阳区有300多年养鹿历史，此地区养殖的梅花鹿是我国特有的梅花鹿品种。

鹿茸蛋白是从鹿茸中提取的一类具多种药理活性的蛋白类物质，占湿鹿茸总质量的52%以上。近年来一系列研究发现鹿茸的主要生物学活性来自于其含量丰富的蛋白质、多肽和寡肽[2－6]。但中国传统的鹿茸加工工艺多为煮炸式的热加工，不易保留蛋白质及多肽类物质的活性。本课题组曾对双阳梅花鹿鹿茸蛋白进行过免疫学活性评估、抗肿瘤等一系列药理作用的研究，研究表明：总蛋白和按分子量截留的蛋白组分确有一定的免疫学活性及低度抑制某些肿瘤细胞系的细胞毒性作用[7]。但是因鹿茸蛋白组分复杂、成分繁多，目前药理活性的重复验证仅仅停留在大体水平上，为进一步弄清其蛋白组分和相关药理活性的对应关系，从分子水平上揭示其导致多重药理学活性的分子作用机制，本实验特选双阳梅花鹿春夏之际生长旺盛期的鹿茸进行研究，采用shotgun技术对吉林双阳梅花鹿鹿茸中高表达蛋白进行了初步的蛋白组学研究和分析，旨在揭示其发挥生物学活性的物质成分基础，为其进一步的临床应用提供基础实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂、仪器

双阳梅花鹿优质二杠鹿茸购自吉林双阳梅花鹿养殖基地。T J－6BECKMAN 离心机（美国Beckman公司）；HD－93－1型核酸蛋白检测仪、FB－2型恒流泵（上海金达生化仪器有限公司）；酶标仪（Tecan sunrise奥地利）。检测仪器型号：LTQ VELOS（Thermo Finnigan，San Jose，CA）；Trap柱：Zorbax 300SB－C18peptide traps（Agilent Technologies，Wilmington，DE）；Column：0.15MM＊150MM （RP－C18）（Column Technology Inc.），Sephadex G25、DEAE Sepharose（瑞典法玛西亚公司），其余试剂均为国产分析纯级。

1.2 鹿茸样品的预处理

取吉林省双阳梅花鹿鹿茸，将其切制成约1cm厚的茸片，倒入约200ml的生理盐水溶液中，用匀浆机匀浆后，置于4℃冰箱中过夜，然后，将匀浆液于4℃，4 000rpm，离心20min。取上清液。配置33%的饱和硫酸铵溶液，用氢氧化铵将其pH调制约7.5，缓慢注入上清液中，放置4℃度沉淀48h。将沉淀悬起。装入50ml离心管中，4 000r，20 min，弃上清液，用20mmol／L PBS溶解沉淀，待除盐。

1.3 鹿茸蛋白的初步分离纯化

1.3.1 Sephadex除盐 将液体泵入Sephadex G－25柱体中（上样前需用0.02mol／L PBS平衡柱体）。连接核酸蛋白紫外检测仪，记录各管流出液蛋白质吸光度值的变化，收集纯化样品放入－20度保存。

1.3.2 DEAE Sepharose分离蛋白 将蛋白样品泵入盛有Sepharose FF柱中（上样前需用20mmol／L Tris－Nacl pH＜8.0平衡。）将配置好的40mmol／L Tris－Nacl缓冲液pH＜8.0泵入柱中。洗涤蛋白杂质。配置 Tris（20mmol／L）－NaCI（1mol／L）高盐缓冲液，将其与低盐缓冲液分别加入梯度混合磁力搅拌器中，进行线性洗脱。并连接核酸蛋白紫外检测仪，记录各管流出液蛋白质吸光度值的变化，Sephadex G－25除盐（方法同1.3.1）。然后将鹿茸蛋白组分I（洗脱峰I）送检到中科院上海生化所蛋白质组中心、上海中科新生命生物科技有限公司进行shotgun分析。上海

1.4 shotgun方法对鹿茸蛋白质的解析

1.4.1 酶解 蛋白质溶液中加入终浓度10mM的DTT，37℃反应1h；然后加入终浓度50mM 的IAA，放置于暗处，反应40min；蛋白质溶液样品用丙酮法沉淀；用25mM的碳酸氢铵复溶；加入1μg Trypsin，37℃反应20h。

1.4.2 毛细管高效液相色谱方法 A液为0.1%甲酸的水溶液，B液为0.1%甲酸的乙腈水溶液（乙腈为84%）。色谱柱以95%的A液平衡后，样品由自动进样器上样到Trap柱。105min，B液线性梯度从4%到50%；105min至114min，B液线性梯度从50%到100%；114min至120min，B液维持在100%。

1.4.3 质谱数据采集 多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描（full scan）后采集20个碎片图谱（MS2scan）。

1.4.4 数据分析 原始文件（raw file）用 BIOWORKS软件搜索相应的数据库。最后得到鉴定的蛋白质结果。搜索使用的数据库为Pecora蛋白库，SEQUEST结果过滤参数为：当Charge＋1，Xcorr≥1.9；当Charge＋2，Xcorr≥2.2；当Charge＋3，Xcorr≥3.75；其中DelCN≥0.1。

1.5 生物信息分析

通过SEQUEST鉴定结果进行相应的GO功能学分析。首先进行gi号与IPI号的转换，然后批量输入到下列在线分析网站 http：／／61.50.138.118／gofact／cgi／gofact2009.cgi，进行生物过程分布、细胞定位和分子功能定位等分析[8]。

2 结果

DEAE Sepharose分离蛋白共得到3个洗脱峰，将洗脱峰I富集并进行shotgun分析，命名为鹿茸蛋白组分I，其shotgun质谱分析图见图1。

2.1 鹿茸蛋白组分I的一般理化性质

共分离出38个蛋白质，其中假想蛋白2个；2个蛋白无IPI号，共提交剩下的注释蛋白34个；其中，蛋白质等电点（PI）跨度为3.71－12.01；相对分子质量（Mw）范围（含蛋白片段）从9.7×103－3.3×105不等。

2.2 鹿茸蛋白组分I的的功能分类

按照IPI号对蛋白质成分进行GOA功能分类，分别是生物过程、细胞定位与分子功能分类。

图1 鹿茸蛋白组分I的shotgun质谱分析图

2.2.1 鹿茸蛋白组分I的生物过程分布 实验鉴定出的34个蛋白质中，7个有生物过程注释。按照生物过程主要分为5类，分别是生物过程调节6个（85.7%）；应激反应2个（28.6%），；细胞稳态1个（14.3%）；碳水化合物代谢1个（14.3%）；信号传递2个（28.6%）。参与生物过程的蛋白质占到鹿茸蛋白组分I总量的25.0%。

2.2.2 鹿茸蛋白组分I的细胞定位 实验鉴定出的34个蛋白质中，13个有细胞定位注释。主要分为4类，分别是细胞来源部分7个（53.8%）；细胞器来源4个（30.8%）；细胞外区域5个（38.5%）；蛋白质复合体1个（7.7%）。由此可见，所提呈的蛋白质中细胞内外分布较为均衡；参与细胞成分的蛋白质占到鹿茸蛋白组分I总量的46.4%。

2.2.3 鹿茸蛋白组分I的分子功能分类 实验鉴定出的34个蛋白质中，15个有分子功能及其分类注释。可分为3类，分别是结合10个（66.7%，其中核酸结合2个；蛋白质结合6个；离子结合5个）；具催化活性2个（13.3%）；具酶调节活性2个（13.3%）。可见鹿茸蛋白组分I中已知最多的为具有结合功能的蛋白质。参与分子功能的蛋白质占鹿茸蛋白组分I总量的53.6%。（注：有的蛋白可以既有生物过程注释，还会有细胞定位抑或分子功能注释。汇总表见表1）

从鹿茸蛋白组分I中发现的某些重要蛋白有：鹿从鹿茸蛋白组分I中发现的某些重要蛋白有：鹿茸胶原蛋白 Collagen alpha－1（III）；alpha－1（XII）；（XXII）等多种亚型；此外还有雌激素受体alpha；细胞骨架蛋白（vinculin）；细胞外基质蛋白（tenascin C）；穿膜神经肽受体（sortilin－related receptor）；细胞之间通讯的细丝蛋白（filamin）；钾离子门控通道亚族 H（potassium voltage－gated channel subfamily H member 3）；着丝点蛋白（centromere protein）等。

表1 已鉴定的鹿茸蛋白功能统计

3 讨论

“东北三宝”之一的鹿茸是我国传统的名贵中药材，是雄鹿密生茸毛未骨化的幼角。每年生长一次。吉林省是梅花鹿养殖大省，存栏量占全国的50%，就数量而言，无一省份或地区能与之匹敌；其中，鲜鹿茸年产量达255.45吨，占全国总量的60%以上，吉林省也因此获得了“梅花鹿资源大省”的美誉。其中，长春地区的“双阳梅花鹿”是我国特有的梅花鹿品种，其育种项目于1990年获国家科技进步一等奖。但一直以来，东北地区所产鹿茸多被制成鹿茸片贱卖，鹿茸片的制作是采用传统的煮炸工艺，其热处理过程破坏了鹿茸中多肽和蛋白质的活性，而占鲜鹿茸总质量52%以上的多肽、蛋白质恰恰是鹿茸中最重要的成分。其具有调节免疫力、组织修复、抗肿瘤、抗衰老等多种生物学活性。

虽然国外在动物蛋白的分离、分析方面一直处于领先地位，但双阳梅花鹿是我国特有品种，故未见国外的相关研究报道。蛋白组学的研究手段及生物信息学分析等日渐成熟，这些高技术的应用对于传统中药的现代化开发具有重要作用。鉴于此，本课题组自2009年即采用了蛋白组学流行的分离、分析手段对鹿茸蛋白组分进行了初步研究。其中，Shotgun方法在蛋白组学方面应用广泛[9，10]，实践证明是强有力的蛋白质组学分析鉴定工具，具操作过程简单、分析速度快、分离效果好、重现性好和灵敏度高等优点。前期样品无需复杂的处理，一般的蛋白粗提物或SDS－PAGE胶上挖取的蛋白皆可。本实验所送检的样品是用DEAE离子交换层析获取的洗脱峰I，经除盐后，浓缩富集后得到。这样的分段研究有助于我们对鹿茸多肽、蛋白研究程序化。便于找到有效的药效学组分。也利于后续鹿茸蛋白的深加工和开发利用。

GO分析是Gene Ontology分析的简称，是生物学家为了衡量基因的功能而发起的一个项目，从分子功能（molecular function）、生物学过程（biological process）和细胞定位（cellular component）三个方面对蛋白功能进行全面定义[11]。是目前蛋白组学分析中常见的分析方法，经过这样的分析和注释，我们会对一个或一组蛋白质有一个全方位的了解和认识。从所鉴定的鹿茸蛋白组分中获悉：生长期鹿茸中蕴藏着巨大的天然蛋白、多肽库，单单是组分I就有很多重要蛋白，诚然，动物蛋白在人体的应用也受到多重限制，但是人类某些疾病的治疗是从动物蛋白中得到启发，本课题组曾在2010年对鹿茸蛋白提取液应用安全性问题进行过初步的研究[12]，发现鹿茸总蛋白经过口服、皮下、腹腔注射等给药途径，对小鼠组织器官有一定的病理性损伤，但不知这种损伤是否和其细胞毒性有关。为了更安全、更有效的开发和利用鹿茸多肽、蛋白。其蛋白组学的研究势在必行，这将为吉林道地中药材的研发提供基础理论依据。

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