IGF－1通过ERK－MNK信号通路诱导骨髓间充质干细胞VEGF表达的实验研究

刘柏含，高艳霞，王占义＊，姬朝光，宫培刚

（1.长春市口腔医院 颌面外科，吉林 长春130051；2.吉林大学基础医学院，吉林 长春130021）

众所周知，胰岛素样生长因子－1（insulinlike growth factor－1，IGF－1）是一种重要的调控因子，因其结构与胰岛素相类似而得名[1，2]。目前，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是直接作用于血管内皮而且作用最强的生长因子，Frerich B等[3]利用IGF－1和 VEGF成功构建组织工程人工血管，发现两种生长因子联用可以获得更好的结果，同时发现IGF－1可以有效的促进多种细胞分泌VEGF，通过增强血管的稳定性从而促进血管生成和新骨形成，然而，IGF－1如何诱导VEGF表达的机制仍在探索中。本实验以体外培养的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）为研究对象，外源性地加入IGF－1后检测细胞中 VEGF、HIF－1α和p－MEK 等相关信号蛋白的表达，同时加入MNK抑制剂CGP 57380和HIF－1α抑制剂YC－1后再检测含外源性IGF－1的细胞中VEGF的表达，从而为探讨IGF－1诱导VEGF表达的可能机制提供实验室数据基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6个月龄雄性新西兰大白兔，购自吉林大学白求恩医学部实验动物中心。

1.1.2 试剂 L－BMSCs（GIBCO BRL，USA）、胎牛血清（GIBCO公司，USA）、Percoll细胞分离液（Pharmacia，Biotec，USA） 、抗 CD29、CD44、VEGF、HIF－1α 和 p－MNK 单 抗 （Santa Cruz Biotech，USA），HRP－羊抗兔IgG购于鼎国生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 骨髓间充质细胞（BMSCs）分离与培养 取新西兰大白兔3%戊巴比妥钠（30mg／1ml／kg）耳缘静脉缓慢注射麻醉，无菌下暴露双侧股骨，牙科钻钻孔，用含有0.1ml肝素的10ml注射器负压吸取骨髓血2－5ml与等量L－BMSCs混合，800rpm／min，离心8min；弃上清，制成细胞悬液；再将细胞悬液轻轻加到离心管内的Percoll淋巴细胞分离液面上2 500rpm／min，离心30min，抽取培养液与分离液液面之间的单个核细胞层细胞，加入L－BMSCs冲洗，1 000r／min，离心8min，反复两次；用含10%胎牛血清的重悬细胞并计数，调细胞浓度为5×106个细胞／ml，接种于50ml塑料培养瓶中，每瓶接种3ml。将细胞置于37℃下5%CO2、95%湿度孵箱中培养，接种1天后半量换液，其后每2天换液1次。待细胞80%～90%融合时，弃去培养液，加入0.25%胰酶，37℃消化细胞。吸取细胞悬液离心洗涤，培养液重悬细胞，以1∶2在培养瓶中进行传代培养，此为第1代细胞。同上方法，细胞依次传代为第2代、第3代，直至第5代。

1.2.2 细胞鉴定 取培养的5代细胞，消化制成密度为1.0×106／mL的单细胞悬液，接种到含有盖片的6孔培养板孔内，每孔接种细胞2ml，37℃下5%CO2孵箱培养过夜。取出盖片，用PBS洗3次，加入CD29单克隆抗体，室温下孵育60min；用PBST洗3次，加入HRP标记的二抗，继续孵育60min，用PBST洗3次，加底物显色后，显微镜下观察，记录结果。

1.2.3 实验分组 实验分4组进行：取第5代细胞继续传代培养，同样浓度接种4瓶，培养4h后，按下列分组加入培养液，进行条件培养。

①每瓶加3ml含3%FCS的BMSCs溶液培养；

②每瓶加3ml含50ng／ml的IGF－1和3%小牛血清的BMSCs培养液；

③每瓶加3ml含5ng／ml CGP 57380、50ng／ml的IGF－1和3%小牛血清的BMSCs培养液；

④每瓶加3ml含5ng／ml YC－1、50ng／ml的IGF－1和3%小牛血清的BMSCs培养液。

条件培养24h后收集细胞用于免疫印迹分析。

1.2.4 免疫印迹分析

1.2.4.1 样品制备 将条件培养的细胞，弃去培养上清，用预冷的PBS洗涤细胞2次。每孔加入含各种蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液1ml，于冰上裂解15min。裂解完后，将裂解液和细胞碎片移至1.5 ml离心管中。用超声裂解仪5KHz，每次裂解1－2 s，重复10次。4℃下，1 2000rpm／min，离心30 min。将离心所得上清转移至新的1ml的离心管中。采用BCA试剂盒进行蛋白定量后，加入等体积2×上样缓冲液后沸水浴煮蛋白10min，用于免疫印迹分析。

1.2.4.2 免疫印迹 将条件培养的细胞裂解液经SDS－PAGE垂直板电泳对蛋白进行分离、采用半干燥转膜仪将凝胶中的蛋白转印到PVDF膜上、再通过用5%脱脂奶粉封闭、先后分别与第一抗体（β－Actin、VEGF、HIF－1α和p－MNK）、二抗孵育后，加ECL试剂显色，凝胶成像系统拍照、记录结果。

2 结果分析

2.1 BMSCs分离、培养与鉴定

本实验原代培养的骨髓细胞传代培养至第5代时，BMSCs呈梭型、漩涡状贴壁生长。其表面标志物CD29、CD44的免疫组化染色显示细胞纯度在90%以上，见图1。

图1 BMSCs的免疫组化鉴定

2.2 条件培养细胞信号传导通路相关分子的免疫印迹分析

IGF－1下游 MAPK信号通路相关分子及VEGF的表达免疫印迹结果显示，与对照组相比，VEGF的表达明显上调，其上游的 HIF－1α及MAPK相关的两个信号蛋白表达明显增高，如图2。加入CGP 57380和YC－1后，VEGF表达减弱，外源性IGF－1的作用减弱，如图3。

3 讨论

骨髓间充质干细胞是一类来源于中胚层的具有强大多向分化潜能的成体干细胞，因为不受伦理限制可以自体移植并可以成骨、成脂、成神经向组织分化而被视为移植首选种子细胞[4－9]。BMSCs在骨髓中含量极低，仅占骨髓有核细胞的0.001%，且随着年龄增大数量逐渐减少，因此，获得相当数量的高纯度的BMSCs是科学研究和临床治疗的应用基础[10]。

图2 条件培养细胞内VEGF、HIF－1α、p－MNK表达的免疫印迹分析

图3 条件培养细胞内VEGF表达的免疫印迹分析

IGF－1与VEGF的协同作用关系早有研究。Slomiany MG[11]通过向体外培养的人视网膜色素上皮细胞系中加入不同剂量的IGF－1发现 HIF－1表达剂量依赖性增加，VEGF也相应增加。Smith LE的研究表明，VEGF介导了IGF－1的新血管生成作用，IGF－1受体拮抗剂抑制VEGF的同时抑制视网膜新血管的形成[12]。Ryo Fukuda等[13]发现IGF－1能够通过PI3K－AKT和MAPK两条通路诱导HIF－1介导的VEGF的表达。本研究中，我们发现外源性上调p－ERK和p－MNK的表达进而促进了VEGF的表达上调，用CGP 57380和YC－1分别阻断p－MNK和 HIF－1α的作用后，外源性IGF－1诱导的VEGF表达上调的效应减弱，这暗示IGF－1通过ERK－MNK信号通路诱导VEGF的表达，但是并不意味着IGF－1与VEGF剂量与时间水平越高越好。多种肿瘤细胞中IGF－1与VE协同作用GF水平高于正常，例如和IGF－1和VEGF的双重抑制会有效抑制卵巢癌生长[14]。最近的一项研究表明：IGF－1可以抗氧化应激[15]。

综上，寻找IGF－1信号通路相关蛋白并确定其特异性调节靶点更有益于相关疾病治疗。

[1]Celiker R，Arslan S.Comparison of serum insulin–like growth factor－1and growth hormone levels in osteoporotic and non－osteporotic postmenopausal wonmen[J].Rheumatol Int，2000，19（6）：205.

[2]李 彦，牛忠英，汤楚华，司少艳.三维培养条件下胰岛素样生长因子－1对人牙周膜细胞增殖及早期成骨向分化的影响[J].中华口腔医学杂志，2011，3（46）：3.

[3]Frerich B，Linde mann N，Kurtz－Hoffmann J，et al.In vitro model of a vascular stroma for the engineering of vascularized tissues[J].Int J Oral Maxillofac Surg，2001，30（5）：414.

[4]Bi Y，Gong M，Zhang X，et al.Pre－activation of retinoid signaling facitates neuronal differention of mesenchymal stem cells[J].Dev Growth Differ，2010，52（5）：419.

[5]Zhang XQ，Li X，Wu T，et al.Isolation，culture and chondrogenic differentiation of goat bone marrow mesenchymal stem cells[J].Nan Fang Yi Ke Da xue xue Bao，2009，29（3）：419.

[6]Shi ZB，Wang KZ.Effects of recombinant adeno－associated viral vectors on angiopoiesis and osteogenesis in cultured rabbit bone marrow stem cells via co－expressing HVEGF and HBMP genes：apreliminary study in vitro[J].Tissue Cell，2010，42（5）：314.

[7]Sotiropoulou PA，Perez SA，Salagianni M，et al.Characterization of the optimal culture conditions for clinical.scale production of human mesenchymal stem cells[J].Stem Cells，2006，24（2）：462－471.

[8]Li Y，Chopp M.Marrow stromal cell transpiantation in stoke and traumatic brain injury[J].Neurosci lett，2009，456（3）：120.

[9]Saulnier N，Lattanzi W，Puglisi MA，et al.Messenchymal stromal cells multipotency and plasticity：induction toward the hepat ic lineage[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2009，13，suppl 1：71.

[10]Abdallah BM，Kassem M.Human mesenchymal stem cells：from basic biology to clinical applications[J].Gene Ther，2008，15（2）：109.

[11]Slomiany MG，Rosenzweig SA.IGF－1－induced VEGF and IGFBP－3secretion correlates with increased HIF－1alpha expression and activity in retinal pigment epithelial cell line D407[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2004，45（8）：2838.

[12]Smith LE et al.Regulation of vascular endothelial growth factor－dependent retinal neovascularization by insulin－like growth factor－1receptor[J].Nat Med，1999，5（12）：1390.

[13]Fukuda R，Hirota K，Fan F，Jung YD，Ellis LM，Semenza GL.Insulin－like growth factor 1induces hypoxia－inducible factor 1－mediated vascular endothelial growth factor expression，which is dependent on MAP kinase and phosphatidylinositol 3－kinase signaling in colon cancer cells[J].J Biol Chem，2002，277（41）：38205.

[14]Shao M，et al.Targeting the insulin growth factor and the vascular endothelial growth factor pathways in ovarian cancer[J].Mol Cancer Ther，2012，11（7）：1576.

[15]Chen C，Xu Y，Song Y.IGF－1gene－modified muscle－derived stem cells are resistant to oxidative stress via enhanced activation of IGF－1R／PI3K／AKT signaling and secretion of VEGF[J].Mol Cell Biochem，2013Oct 15.[Epub ahead of print]