DNA免疫吸附柱配基DNA免疫原性的研究

董凡，孙万邦，刘学东（.珠海健帆生物科技股份有限公司，广东 珠海 59000；.遵义医学院，贵州 遵义 563003）

国外学者早在1979年前就开始研究使用小牛胸腺DNA作为配基制备免疫吸附剂[1-7]，国内学者在1985年使用小牛胸腺DNA作为配基制备免疫吸附剂研究取得了突破性进展[8-15]，南开大学在大量国外研究的基础上自主创新，成功研制出DNA免疫吸附柱，实现了高科技产品产业化的转变，并于20世纪80年代获得国家批文，1988年进入临床使用，显示其是一种疗效高、血液相容性良好、治疗难治性免疫疾病的新方法[16-24]。其中最重要的功能基团小牛胸腺DNA，作为核酸分子属于低免疫原性的大分子物质，针对该物质的免疫原性研究国内鲜见报道，其作为血液灌流产品在临床应用时是否会产生免疫原性至今尚未见报道。本研究针对该产品的使用方式采用常用的免疫原性研究方法[25-30]，初步探讨DNA免疫吸附柱配基的免疫原性。

1 材料与方法

1.1 供试品的制备

健帆伊美诺免疫吸附柱（由珠海健帆生物科技股份有限公司生产），按照以下方法制备受试液：① 根据产品配载量（0.3～0.5 mg/L树脂）计算一个柱体中配载的DNA量约为100 mg，按正常成人体重60 kg计算，相当于1.67 mg/kg，按照《医用实验动物学》[27]人与动物之间药物剂量的换算方法，得出每只兔的总用量约为8 mg，按照免疫程序分4次皮下注射1 mg/L，每次注射2 ml。1 mg/ml DNA溶液配制成100 ml，灭菌瓶分装4份密封低温保存，作为DNA高剂量组注射用液。② 考虑产品在临床使用过程中可能脱落的DNA有机会进入人体是在体外循环灌流治疗的2小时内，同时考虑人与动物间药物剂量的换算方法和兔皮下注射的容积要求，将存放最长效期的产品按临床应用程序预冲后，以治疗时流速200 ml/min，用200 ml生理盐水循环冲洗2小时后回收液体，按照动物与人的等效剂量换算方法，得出每只兔的总用量约为14 ml，按照免疫程序分4次注射，每次约3 ml。回收的液体用灭菌瓶分装4份密封低温保存。用于DNA低剂量组和DNA低剂量加佐剂组注射用。③ 生理盐水作为对照组注射用液。

1.2 主要试剂

兔用抗双链DNA抗体检测试剂盒；四甲基偶氮唑盐（MTT）细胞培养液及细胞培养板。

1.3 免疫原分组及处理

选择健康兔24只，体重2.0～2.5 kg，雌雄不限，按随机数字表法分为4组，每组6只。各组每次每只兔注射剂量：① 高剂量组2 ml DNA溶液。② 低剂量组3 ml DNA溶液。③ 低剂量加佐剂组3 ml生理盐水与3 ml佐剂混合乳化。④ 空白对照组4 ml生理盐水。4组均选择兔颈后及两侧后肢大腿外侧3个部位多点注射；共注射4次，每次间隔1周。

本实验中动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.4 检测指标及方法

① 于末次注射后7天由心脏取血或颈动脉放血采血，用双向琼脂扩散实验及酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗体效价，操作按试剂盒说明书进行。② 取DNA实验组和正常对照组兔肝、肾组织，行苏木素-伊红（HE）染色，光镜下观察组织病理学变化。③ 取脾脏，分离淋巴细胞。以双链DNA为实验组，非特异性免疫刺激剂刀豆蛋白（ConA）作为阳性对照组，以细胞培养液作为阴性对照组，与免疫兔外周血淋巴细胞进行体外培养，用MTT法观察脾淋巴细胞增殖情况，在波长450 nm处检测其吸光度（A）值。

1.5 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用F检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清抗体效价检测

ELISA检测结果显示，双链DNA无免疫原性，不能刺激兔产生相应抗体（F=1.183，P=0.341；图1）。双向琼脂扩散实验结果显示，双链DNA不能刺激兔免疫系统产生相应抗体（图2）。

图1 ELISA检测血清抗体效价

图2 双向琼脂扩散实验检测血清抗体效价

2.2 MTT法检测脾脏淋巴细胞增殖数（表1）

阳性对照组脾脏淋巴细胞增殖数较阴性对照组显著增高，差异有统计学意义（P＜0.01），DNA实验组与阴性对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。3组间比较差异无统计学意义（F=1.183，P=0.336），表明双链DNA不能刺激兔淋巴细胞发生增殖。

表1 MTT法检测脾脏淋巴细胞增殖数（±s）

表1 MTT法检测脾脏淋巴细胞增殖数（±s）

注：与阴性对照组比较，aP＜0.01

组别 样本数 淋巴细胞增殖数（A值）阴性对照组 30 0.241±0.040阳性对照组 30 0.850±0.070 a DNA实验组 30 0.576±0.078

2.3 免疫兔肝、肾组织病理学观察

2.3.1 正常对照组

肝小叶结构尚存，肝细胞有轻度水肿，胞质疏松，肝窦狭窄，间质血管充血。肾脏结构正常，肾小球毛细血管扩张，球内可见较多红细胞。

2.3.2 DNA试验组

肝小叶结构清晰可见，肝细胞索和肝窦易区分，结构正常（图3a），肝汇管区见淋巴细胞浸润（图3b），肝细胞轻到中度浊肿（图3c），肝汇管区见淋巴细胞浸润（图3d）。肾小球充血，肾小管正常（图 3e～3f）。

3 讨 论

针对配基DNA的免疫原性研究是基于对DNA免疫吸附柱的临床使用安全性角度出发，该产品的工作原理是靠抗原抗体结合来清除DNA抗体，同时载体（碳化树脂）的非特异性吸附能力对体内的一些大分子物质也可清除。理论上DNA这类核酸分子属于无免疫原性物质，但因其来源于小牛胸腺，提取过程需保证其纯度。经典的DNA提取方法由于不同的提取方法原理、使用的试剂、操作时间、难度不同，使其对DNA分子的破坏程度不同，可能造成所提取的DNA的分子质量分布宽度不同[28]，因此，本研究方法设计时参考了胸腺肽、核酸类注射剂等药物的研究方法[25-26，29]。

本研究根据抗体检测实验结果显示无抗体产生，因此分析肾基底膜等部位也不会有免疫复合物沉积。组织病理学观察也证实，DNA实验组兔肝、肾等器官无明显病理学改变。

图3 DNA实验组肝脏（3a～3b）和肾脏（3e～3f）组织病理学改变（HE 高倍放大）

采用小牛胸腺DNA作为配基制备的免疫吸附柱也经过了大量的临床使用，体外研究实验发现其可选择性地清除抗DNA抗体，且没有检测到DNA脱落[2，4，9]；部分学者还进行了重症银屑癣和支气管哮喘的临床研究，疗效显著[30-31]，具有选择性吸附、疗效高、安全的特点，为系统性红斑狼疮等难治性疾病的治疗提供了新的方法。