微生物冷冻干燥保藏技术的影响因素分析

李伟杰，蒋桃珍，魏财文，岂晓鑫，田 野

(中国兽医药品监察所，北京100081)

微生物保藏就是对活体微生物群体进行有效的保藏，微生物保藏的基本目的是保持其纯度、活性并尽可能减少变异，最终目的是为科技创新和生物经济发展提供有效的支撑。目前用于微生物的保藏技术可以分为四类:传代法、干燥法、冷冻法和冷冻干燥法［1］，其原理主要是运用干燥、低温和隔绝空气的手段，抑制微生物的新陈代谢，使其生命活动处于半永久性休眠状态，从而达到保藏的目的。现在简易的保藏方法，例如定期移植法、液体石蜡法，在很多实验室和保藏机构还在使用，而砂土保藏法、硅胶干燥法等简易的保藏方法，已经很少见到。当今公认的最安全、最可靠的长期保存微生物的方法是冷冻法和冷冻干燥法，它们适用于大多数微生物的保藏。

冷冻干燥保藏技术适用范围广泛，除少数不产生孢子只产生菌丝体的丝状真菌不宜采用外，其它微生物如细菌、病毒等均可采用此方法。其基本原理是微生物和冻干保护剂在低温下先行冻结至共晶点以下，然后在适当的真空环境下进行冰晶升华干燥，随后进行解吸干燥，除去部分结合水，从而获得干燥的微生物产品，最后进行真空熔封，在低温、避光环境下保藏［2］。

1 影响冷冻干燥保藏的因素

1.1 菌龄和细胞浓度 冻干微生物的菌龄对其冷冻干燥保藏后细胞存活率有重要影响，例如鼠李糖乳杆菌在生长的稳定期进行冷冻干燥，细胞存活率为31% ～50%，而在生长对数期为14%，在生长迟缓期仅为2%［3］。研究表明:生长时期不同，细胞的生理状态差异很大，对外界环境条件的反应程度不一。处于稳定期的细胞或成熟的孢子对不良环境具有较强的抗性，因而，保藏不产芽孢细菌、酵母菌，应采用对数末期或稳定期初期的细胞;而保藏产芽孢细菌、放线菌和霉菌，要用成熟的孢子，相应的时期为产芽孢细菌在细胞的分化阶段、放线菌在生长II期，霉菌在无性孢子繁殖期和有性孢子繁殖期。在冷冻干燥保藏技术中，为保证在使用时有足够数量存活的细胞，冻干前通常要加大细胞密度，细菌和放线菌浓度一般在108～109CFU/mL，酵母菌和霉菌孢子的浓度一般要大于107CFU/mL。

1.2 冻干保护剂 冻干保护剂可分为小分子保护剂(如低聚糖类、醇类和缓冲盐类)和大分子保护剂(如蛋白质、多肽类和多糖类)。小分子保护剂，一般具有很强的亲水性，分子结构中含有氢键，在冷冻或干燥过程中，可与菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团或菌体蛋白质极性基团形成氢键，保护细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性。而大分子保护剂通过“包裹”形式保护菌体，同时，促进低分子保护剂发挥作用［4］。保护剂类型的选择主要取决于菌株的生物学特性，脱脂牛乳、血清、蔗糖等既是有效的冻干保护剂又是很好的低温保护剂。研究表明利用海藻糖作为冻干保护剂可以提高微生物的存活率［5］，其中一个重要原因是海藻糖的玻璃化温度较高，而玻璃化温度越高，冻干样品在温度升高时更容易保持稳定。由于蛋白的玻璃化温度相对更高，因此在微生物保藏中经常把蛋白和糖的混合物作为冻干保护剂。Abadias等［6］试验表明 Candida sake利用脱脂牛乳和碳水化合物作保护剂，菌株细胞存活率可达85.9%。

1.3 冷冻干燥工艺

1.3.1 预冻 预冻过程一方面要保护微生物的主要性能不变，另一方面要获得冻结后微生物有合理的结构，以利于水分的升华。预冻效果主要由3个方面决定:预冻速率、预冻最低温度、预冻时间。(1)预冻速率是影响微生物存活率的重要因素，由于微生物细胞对水分的渗透率不同，导致不同微生物最佳预冻速率不同。快速冻结，胞内的水分来不及通过细胞膜渗出，胞内溶液过冷而结冰，细胞的体积膨大，最后导致细胞破裂;慢速冻结，胞外溶液中水分大量结冰，溶液的浓度提高，胞内的水分便大量向外渗透，导致细胞的剧烈收缩，造成细胞损伤［7］。实验证明，快速冻结导致升华速率低，解吸速率快，慢速冻结反之。实际上一般冻干微生物样品的预冻速率介于快冻与慢冻之间。就细菌而言，通常采用分段降温速率，从室温快速降到约4℃，然后每分钟降低1℃至－40℃，最后按每分钟3～5℃的速率降至－70℃左右［7］。(2)预冻最低温度一般应低于溶液共晶点温度，即在共晶点温度以下8～10℃。共晶点与微生物类群、保护剂的种类和浓度有关。(3)适宜的预冻时间是指一次干燥之前所有的微生物样品均已冻实所需要的时间，以免因抽真空而引起喷瓶。若预冻时微生物样品冻结不实，冻干后微生物样品表面凹凸不平。一般要求冻干瓶装厚度不超过10 mm。微生物样品的固体含量一般为2% ～10%，如低于2%，冻干微生物样品结构的机械性能就可能不稳定，而高于10%则冻干不易成功，且复水也比较困难［8］。

1.3.2 一次干燥(升华干燥) 一次干燥主要是使微生物样品中冻结的自由水升华逸出。升华干燥的时间与微生物样品的种类、分装的厚度及升华时提供的热量有关。冻干期间水升华的驱动力为微生物样品与冷阱之间的温差。通常升华干燥阶段冷阱温度为－60℃(至少比微生物样品温度低20℃)。解吸干燥阶段冷阱温度要求低至－80℃，这样获得的冻干品残留水量较少。为达到较快的干燥速度，微生物样品温度要求尽可能高，但必须低于共晶点温度或崩解温度，以防止微生物样品熔化或崩解，出现干缩和鼓泡现象，造成微生物冻干样品溶解性差［9］。在冻干时主要靠传导方式提供热量，冻干品的热量主要从搁板获得，搁板与微生物样品之间有效的热传递与界面温度所对应的饱和蒸汽压和干燥室内真空度之差有关。升华阶段的真空度在10～30 Pa时，较有利于热量的传递和升华的进行。若压强过低，则对传热不利，微生物样品不易获得热量，升华速率反而降低，对设备的要求也更高;而当压强过高时，微生物样品内冰的升华速度减慢，微生物样品自身温度会上升，当高于共晶点温度时微生物样品将发生熔化而导致冻干失败。干燥室壁温、底盘侧边高度、安瓿瓶的排列方式均会影响传热效果，并将影响升华速率［10］。

1.3.3 二次干燥(解吸干燥) 二次干燥主要是去除部分结合水。这部分水主要靠范德华力和氢键吸附在微生物样品上，需要更多的能量才能将其除去。升华干燥后微生物样品残留水分通常在10%左右，解吸干燥后残余水分一般应低于2%。冻干微生物样品中的残留水分对冻干微生物质量影响很大，残留水分过多，微生物容易失活，稳定性变差。为控制冻干微生物样品中的残留水分，解吸干燥时应在保持微生物样品活性的条件下选择允许的最高温度，真空度需尽可能提高，一般这一过程需4～6 h。自动化较高的冻干机可通过压力升高试验以获得对残留水分进行控制的相应数据。微生物冷冻干燥一般工艺曲线见图1［11］，在实际应用中要根据不同微生物种类和选用的冻干保护剂做适当的优化和调整。

图1 冷冻干燥一般工艺曲线

2 冻干微生物样品的常见问题及解决措施

2.1 喷瓶现象 喷瓶现象是由于微生物样品在预冻时，没有完全冻实就抽真空的缘故。解决方法是适当延长预冻时间。

2.2 干缩现象 干缩现象是由于微生物样品在升华干燥过程中，温度超过了共晶点或崩解温度，出现局部熔化，由液体蒸发为气体，造成体积缩小，或者干燥产品溶入液体之中，造成体积缩小。解决方法是降低加热温度和提高冻干箱的真空度。

2.3 剩余水分不合格现象 剩余水分不合格是由于解吸干燥的时间不够，或微生物样品达到允许的最高温度后未恢复高真空。解决方法是延长解吸干燥的时间，并在产品达到允许的最高温度后恢复高真空。

2.4 溶解性差的问题 产品干燥过程中发生局部浓缩，例如产品内部有夹心的硬块，它是在升华中发生熔化，产生蒸发干燥浓缩造成的。解决方法是适当降低板层温度，提高冻干箱的真空度或延长升华干燥的时间［9］。

3 结语

微生物冷冻干燥保藏技术涉及生物学、机械、制冷、真空和自动化控制等多门学科，影响因素众多，包括菌龄、细胞浓度、冻干保护剂、冷冻干燥工艺、安瓿瓶的规格等。随着微生物冷冻干燥保藏技术与设备的日益完善，以及对影响微生物冷冻干燥保藏各种影响因素的深入研究，可以使我们不断提高微生物保存的质量，延长其保存期限，进而对其质量加以控制。

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