黄芪多糖注射液中非法添加地塞米松磷酸钠的检查方法研究

顾明芬，陈小秋

(天津市兽药饲料监察所，天津300402)

地塞米松磷酸钠是肾上腺皮质激素类药物。具有抗炎、抗过敏、抗风湿、免疫抑制作用，常用于过敏及自身免疫性疾病［1］。在黄芪多糖注射液中非法添加地塞米松磷酸钠的情况时有发生，为了打击非法添加行为，故建立黄芪多糖注射液中非法添加地塞米松磷酸钠的检查方法迫在眉睫。地塞米松磷酸钠原料药和注射液的检测方法主要是高效液相法，本研究在此基础建立了黄芪多糖注射液中非法添加地塞米松磷酸钠的高效液相检查方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 对照品来源 地塞米松磷酸钠对照品，中国兽医药品监察所，含量94.7%，批号H0240805。

1.1.2 样品来源 黄芪多糖注射液，天津市保灵动物保健品有限公司，规格10 mL:0.2 g，批号:201308021。

1.1.3 试剂试药 甲醇，色谱纯;乙腈，色谱纯;稀硫酸，分析纯;纯化水，自制。

1.1.4 仪器设备 电子天平:METTLER TOLEDO公司，感量0.00001 g，型号/编号:AB265-S;高效液相色谱-二极管阵列检测器型号:Agilent1200;数控超声波清洗器:KQ-250DE型，昆山市超声仪器有限公司;5 mL注射器;0.22 μm混合滤膜。

1.2 方法

1.2.1 阴性样溶液配制 精密量取黄芪多糖注射液10 mL，置100 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，备用。

1.2.2 地塞米松磷酸钠对照品溶液配制 精密称定地塞米松磷酸钠对照品10.06 mg，置100 mL量瓶中，加流动相适量，超声溶解并稀释至刻度，摇匀，得100 μg/mL对照品溶液;分别用流动相稀释成浓度为 50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1 μg/mL 的系列对照品溶液。

1.2.3 地塞米松磷酸钠供试品溶液配制 精密量取黄芪多糖注射液1 mL，置10 mL量瓶中，精密加入1.2.2项下的对照品溶液适量，加流动相稀释至刻度，摇匀，得 50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05 μg/mL的系列样品溶液。

1.2.4 色谱条件［2］色谱柱Thermo BDS HYPERSIL C18，5 μm，4.6 ×150 mm;流动相为三乙胺溶液(取三乙胺7.5 mL，加水稀释至1000 mL，用磷酸调节pH值至3.0±0.05)-甲醇-乙腈(55∶40∶5);柱温30 ℃;进样量10 μL。

1.2.5 专属性考察 按1.2.4项下色谱条件，分别对地塞米松磷酸钠对照品溶液、供试品溶液和样品空白溶液和试剂空白溶液进行分析。

1.2.6 检出限 精密量取黄芪多糖注射液1 mL，分别精密加入1.2.2项下的地塞米松磷酸钠对照品溶液适量，制成系列添加浓度:0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 μg/mL。精密量取 10 μL，注入液相色谱仪，按照1.2.4项下液相条件记录色谱图。光谱图不失真的浓度的2倍作为最低检出限。

1.2.7 回收率试验 精密称取6份地塞米松磷酸钠对照品50 mg置100 mL量瓶中，加黄芪多糖注射液，超声溶解并稀释至刻度，摇匀，得500 μg/mL样品溶液;精密量取样品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，得50 μg/mL的溶液，精密量取10 μL，注入液相色谱仪，按照1.2.4项下液相条件记录色谱图。计算回收率。

1.2.8 耐用性考察 30、25、20℃ 3个不同柱温;200 mL流动相中添加甲醇2 mL、甲醇10 mL和甲醇2 mL+乙腈5 mL;3个不同pH 值2.8、3.0、3.2的流动相;3款不同色谱柱(Thermo BDS HYPERSIL C18，5 μm，4.6 ×150 mm;Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18，5 μm，4.6 × 150 mm;Waters SymmtryⓇC18，5 μm，4.6×150 mm对分离度、峰纯度指示、光谱相似度进行考察。

2 结果与分析

2.1 专属性考察 结果表明，试剂空白和样品空白溶液中无地塞米松磷酸钠吸收峰，供试品色谱图中地塞米松磷酸钠与相邻峰的分离度均大于1.5。峰纯度检查:地塞米松磷酸钠色谱峰光谱均匀，纯度较高，可认为单一物质。光谱相似度检查:供试品溶液地塞米松磷酸钠色谱峰与光谱库中地塞米松磷酸钠对照品的光谱匹配(图1～图6)。

图1 系统适用性色谱图

图2 色谱图性能

图3 光谱图和纯度检查图

图4 光谱图和纯度检查图

图5 添加样品色谱图

2.2 最低检测限

2.2.1 对照品溶液峰位确立 取1.2.2项下的地塞米松磷酸钠对照品溶液(100 μg/mL)适量，用微孔滤膜滤过，精密量取10 μL，注入液相色谱仪，按照1.2.4项下液相色谱条件记录色谱图。

图6 空白基质(样品和试剂)的色谱图

2.2.2 检测限的确立 综合考虑色谱图峰形、峰面积和地塞米松磷酸钠药物有效浓度等因素，结果表明，上机浓度 2 μg/mL，光谱图失真;上机浓度5 μg/mL，光谱图不失真，这样就确定上机浓度10 μg/mL为检出限，即可确定黄芪多糖注射液中地塞米松磷酸钠的检测限为100 mg/L，对应黄芪多糖注射液中含量0.01%(图7～图8)。

图7 检出限色谱图

2.3 回收率试验 结果如表1所示。

表1 黄芪多糖注射液添加地塞米松磷酸钠回收率试验结果(n＝6)

图8 光谱图和纯度检查图

2.4 耐用性 柱温、流动相比例、流动相pH值和色谱柱的改变对分离度、峰纯度指示、光谱相似度的考察结果显示，能够满足要求，只是保留时间变化，柱温变化:11.916 min、13.822 min和16.343 min;流动相组分变化:从11.916 min分别变为12.482 min、9.611 min和8.953 min;流动相pH值变化:12.478 min、11.916 min和12.974 min;不同色谱柱变化:11.916 min、17.696 min 和 19.095 min。

3 结论

3.1 黄芪多糖注射液阴性溶液在与地塞米松磷酸钠对照品相同保留时间处，无色谱峰出现，证明黄芪多糖注射液对地塞米松磷酸钠的检查无干扰，即本检查法对黄芪多糖注射液适用。

3.2 在黄芪多糖注射液添加对照品的系列浓度色谱图中，5、10、20 μg/mL 添加浓度均能可靠地检出地塞米松磷酸钠，综合考虑色谱图峰形、峰面积和地塞米松磷酸钠药物有效浓度等因素，按照制定本方法要求不失真浓度的2倍为检出限，拟定黄芪多糖注射液中地塞米松磷酸钠的检测限为0.1 mg/mL，对应黄芪多糖注射液中含量0.01%。

3.3 本检测方法已于2014年1月16日由中华人民共和国农业部以第2508号公告发布实施。

［1］中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典兽药使用指南［M］.

［2］中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典 二○一○年版［S］.