高效液相色谱法测定杨树花口服液中水杨苷的含量

韩 立，班付国，周红霞，邱天宝，刘素梅，张跃京

(河南省兽药监察所，郑州450008)

杨树花为杨柳科植物毛白杨(Populus tomentosa Carr.)、加拿大杨(Populus canadensis Moench.)或同属数种植物的干燥雄花序［1－2］，主要药用成分为酚苷类化合物和黄酮类化合物［3－4］。杨树花口服液是杨树花经提取制成的合剂，收载于《中国兽药典》二○一○年版二部，每1 mL相当于原生药1 g，多为水提醇沉法生产［5］，具有清热解毒、化湿止泻的功效，主治湿热下痢，幼畜泄泻。在畜牧业中，杨树花及其制剂广泛应用于羊、猪、兔等动物的腹泻、细菌性痢疾等疾病［6－8］。目前质量标准仅有理化鉴别，不能有效控制药品质量。因此研究杨树花化学成分，定量测定活性成分含量，对于控制杨树花口服液质量具有重要的意义。水杨苷具有解热镇痛和苦味健胃助消化作用，是杨树花口服液清热健胃的主要有效成分，可溶于水，易溶于沸水，也是杨树花口服液的主要活性成分。因此定量检测杨树花口服液中的水杨苷含量，有助于完善产品质量标准，指导生产，提高药品质量［9］。本试验以水杨苷为参照物，测定了杨树花口服液中水杨苷的量，对于控制药品质量和完善标准很有实用性。

1 仪器与试剂

Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪(美国Waters公司)配置UPLC PDA光电二极管阵列检测器/UPLC TUV紫外检测器，Empower2色谱工作站采集数据;METTLER TOLEDO XP205电子天平(十万分之一，瑞士METTLER TOLEDO公司);Milli－Q Advantage A10超纯水系统(美国 Millipore公司)。

甲醇(色谱纯)，中性氧化铝(层析用)，纯化水，水杨苷对照品(含量 98.0%，批号 4.530013.0001，ANPEL Scientific instrument Co.Ltd.)。杨树花口服液样品 3批(批号分别为 12101101，12101102，12101103，均由 1家兽药生产企业提供)。

2 方法与结果

2.1 检测波长的选择 采用DAD检测器在210 nm～400 nm对对照品进行全扫描(图1)，水杨苷分别在212、268、339、384 nm 波长下有最大吸收，其中212 nm下吸收最大。分别比较4个波长下样品的色谱图，发现水杨苷虽然在212 nm下吸收最大，但是杂质吸收也较大，而在268 nm～270 nm下有比较大的吸收，且峰形较好，基线平稳，分离度较高，所以将检测波长定为269 nm。

图1 对照品光谱图

2.2 色谱条件与系统适用性试验 流动相为甲醇—水(10∶90);色谱柱:Waters XBridge C18，150 mm ×4.6 mm，5 μm;检测波长 269 nm;流速1.0 mL/min;进样量:10 μL;柱温30 ℃。理论板数按水杨苷峰计算不低于3000，主峰的保留时间约为17.4 min(图2－图3)。

图2 对照品色谱图

图3 杨树花口服液色谱图

2.3 对照品溶液的制备 精密称取水杨苷对照品53.26 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇制成每mL含0.5326 mg 的溶液，过0.45 μm 微孔滤膜，即得水杨苷对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备 精密量取杨树花口服液2 mL，过中性氧化铝柱(内径为1.5 cm，5 g)，收集流出液，再用40 mL水洗脱，流出液和洗脱液合并至50 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，作为供试品溶液。

2.5 线性关系考察 取水杨苷对照品适量，加水配制成含0.5 mg/mL的对照品溶液，分别稀释成0.025、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/mL，精密量取 10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以水杨苷浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，计算得回归方程为:y＝1966x+15423，相关系数 r=0.9995，结果表明水杨苷在 0.025～0.5 mg/mL 的浓度范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验 精密吸取水杨苷对照品溶液10 μL注入色谱仪，记录色谱图，连续进样6次测定峰面积。结果相对标准偏差(RSD)为0.52%，表明系统精密度符合要求。

2.7 稳定性试验 取同一批供试品溶液，分别在样品处理后的 0、1、2、8、12 h 进样，测定峰面积，考察样品稳定性。结果表明，供试品溶液12 h内基本稳定，RSD 为0.75%。

2.8 重复性试验 取批号为12101101的杨树花口服液，精密量取2 mL，平行6份，依法进行提取、测定，计算计算每份样品中水杨苷的量，结果6份样品中水杨苷的平均含量为3.3813 mg，RSD为0.76%，表明该方法重复性良好。

2.9 回收率试验 取批号为12101101的杨树花口服液，精密量取1 mL，平行6份，精密加入水杨苷对照品溶液5 mL(相当于约2.6630 mg的水杨苷)，按照供试品溶液制备方法制成加样供试品溶液，精密吸取加样供试品溶液10 μL，按上述方法测定，计算回收率，结果表明，本法具有良好的回收率，见表1。

表1 水杨苷回收率试验

2.10 样品的测定 取同一公司3批杨树花口服液样品，每批量取两份，按供试品处理方法处理。取10 μL样品溶液注入色谱仪，记录色谱图，平行进样两次，计算平均含量。各批次样品的含量见表2。

表2 样品测定结果

3 讨论与小结

3.1 样品的净化 试验比较了样品过中性氧化铝柱和不过中性氧化铝柱的效果。发现不过中性氧化铝柱时，供试品溶液颜色较深，进样后杂质峰较多，很难与目的峰分离。当样品过中性氧化铝柱后，供试品溶液颜色变浅，杂质峰明显减少，样品的含量几乎没有变化。可以推断，色素等杂质被中性氧化铝吸附，但水杨苷基本都被洗脱下来。

3.2 样品的含量 试验测定了同一公司3批样品，水杨苷含量范围为3.4 mg/mL左右。由于药材来源不同，不同公司的生产工艺存在差异，杨树花口服液中水杨苷含量相差可能较大。通过对自制的每1 mL相当于原生药1 g的杨树花煎煮液进行检测，水杨苷含量达到10.8 mg/mL左右。参照《中国兽药典》杨树花口服液标准，有必要对杨树花口服液中水杨苷的收率以及不同来源的杨树花口服液中水杨苷含量进行进一步的测定和考察，以制定出合理的含量限度。

水杨苷是杨树花口服液的主要成分和活性物质，试验以水杨苷为定量目标化合物，对于完善产品质量标准，提高药品质量具有现实意义。

［1］中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○一○年版二部［S］.

［2］中国药典委员会.中华人民共和国药典一九七七年版一部［S］.

［3］梁延寿，张清芳.杨树花化学成分的研究［J］.中药通报，1988，13(1):41－42

［4］房春林.杨树花及其复方制剂药学与临床应用研究［D］.雅安:四川农业大学，2010.

［5］杨海涵，房春林，李 超，等.杨树花提取工艺研究［J］.中国动物保健，2011，13(4)21－23.

［6］张玉果，郝智松.治疗畜禽下痢的中药:杨树花口服液［J］.北方牧业，2013，43(16):29

［7］张玉果，郝智松.杨树花口服液在治疗猪肠炎中的临床应用［J］.兽药市场指南，2013，(8):37

［8］潘继兰.杨树花防治羔羊痢疾［J］.当代畜禽养殖业，2005，(4):22

［9］李来生，黄伟东，何 琦，等.高效液相色谱法测定柳树皮提取物中的水杨甙［J］.色谱，2001，19(5)446 －447