A型魏氏梭菌α毒素Asp-56基因定点突变与结构分析

宫语晨，许崇利，钱爱东*，许崇波

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118;2.吉林化工学院化工与生物技术学院，吉林吉林132022;3.大连大学医学院，辽宁大连116622)

A型魏氏梭菌(Clostridium welchii type A)是引起人畜创伤性气性坏疽的主要病原菌之一，该菌主要致病因子是α毒素。α毒素是由370个氨基酸组成的单链多肽，是一种依赖于锌离子具有磷脂酶C(PLC)活性的金属酶，它能水解细胞膜的磷脂酰胆碱，破坏细胞膜完整性，导致细胞裂解，从而具有细胞毒性、溶血性、致死性和皮肤坏死性等特性［1-3］。α毒素具有酶分子的结构特征，其活性部位包括催化位点和结合位点。α毒素的第56位天冬氨酸(Asp-56)是锌离子的结合位点，又是α毒素的磷脂酶C催化位点，α毒素Asp-56对其具有生物学活性至关重要［4-6］。但关于α毒素Asp-56突变前后的生物学活性和分子结构的变化以及二者之间的关系尚不清楚。为此，本实验选择影响α毒素磷脂酶C活性第56位Asp-56进行定点突变，开展α毒素Asp-56突变前后分子结构和生物学活性的研究，为今后研究α毒素分子结构对其生物学活性的影响以及α毒素的作用机制奠定基础，同时为下一步研制α毒素基因工程亚单位疫苗提供候选工程菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体、菌种和实验动物 表达载体pET-32a和受体菌E.coli BL21(DE3)均购自Novagen公司;含α毒素基因的重组质粒pXETA02由大连大学许崇波教授惠赠［7］;昆明系小鼠购自吉林大学农学部实验动物中心，16～18 g，雌雄各半。

1.1.2 试剂 Ex Taq PCR试剂盒、限制性核酸内切酶 (BamH I、EcoR I、Nco I)、QDL2000 DNA Marker和IPTG均购自宝生物工程(大连)有限公司;Wizard PCR preps DNA Purification System、T4DNA连接酶购自Promega公司;琼脂糖为Biowest公司产品;卡那霉素、氨苄青霉素购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 α毒素D56G突变体基因PCR引物的设计与合成 根据A型魏氏梭菌α毒素基因序列［8］，设计α毒素D56G突变体基因PCR引物:引物P1:5’-CATGCCATGGCAATGAAAAGAAAGATTTGT-3’，引物 P2:5’-TGGATAAG TAGAACCTAATTG-3’，引物 P3:5’-GGTTATGATAAGAATGCATAT-3’(突变引物)，引物 P4:5’-CCGGAATTCTTTTATATTATAAGTTGAATT-3’，引物 P1含有 Nco I限制性内切核酸酶碱基(斜体部分)和保护性碱基，引物P4含有EcoR I限制性内切核酸酶碱基(斜体部分)和保护性碱基，引物P3为含有突变碱基的突变引物，PCR引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

PCR 体 系 (50 μL):10 × PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 5 μL，模板pXETA02 DNA 1 μL，引物 P1 和 P2(0.1 μmol/L)各1 μL，ddH2O 36 μL，Ex Taq DNA 聚合酶(2.5 U/μL)1 μL。

PCR条件:95℃ 5 min;95℃ 60 s，55℃ 60 s，72℃ 60 s，共30个循环;72℃ 10 min。

1.2.2 α毒素D56G基因的定点突变与重组表达质粒pM-D56G的构建 用引物P1和P2从模板pXETA02质粒中扩增0.26 kb基因片段，再用引物P3和P4从模板pXETA02质粒中扩增0.94 kb基因片段，回收二者的PCR片段，用T4DNA连接酶连接，然后以连接产物为模板，用引物P1和P4再进行扩增，即可得到带有突变位点的1.2 kb α毒素D56G突变体基因，最后进行酶切鉴定和核苷酸序列测定［9］。

1.2.3 重组菌株BL21(DE3)(pM-D56G)在大肠杆菌中的诱导表达及包涵体变性与复性 参照文献［10-11］，将 250 mL 重组菌株 BL21(DE3)(pMD56G)培养液在4℃于7000 r/min离心10 min，弃掉上清的菌体，用 50 mL缓冲液［20 moL/L Tris-HCl(pH 8.0)］悬浮混匀，在4℃于7000 r/min离心10 min。重复洗涤菌体一次。用300 mL缓冲液［1 moL/L Tris-HCl(pH 8.0)］悬浮混匀菌体，然后于冰水浴中进行超声波破碎。超声波破碎菌体的条件是:功率400 W，超声5 s，间歇5 s，共45 min。超声波破碎菌体结束后，在4℃ 10000 r/min离心30 min，弃掉上清的沉淀物用洗涤液［20 mmoL/L Tris-HCl(pH 8.0)，0.5 moL/L尿素］悬浮混匀。重复洗涤沉淀物一次，再用500 mL洗涤液重悬沉淀，所得产物即为包涵体。

按照变性液与包涵体1∶40的比例，加入变性液［20 mmoL/L Tris-HCl(pH 8.0)，8 moL/L 尿素，0.1% β-巯基乙醇］，迅速重悬包涵体，于37℃ 变性2 h，然后在4℃ 12000 r/min离心10 min。把上清液移入处理过的透析袋并密封后，放进已加入150 mL复性液［20 mmoL/L Tris-HCl(pH 8.0)，尿素浓度梯度分别为 6、4、2、0 moL/L］的烧杯中开始进行梯度透析复性。间隔6 h更换一次复性液，复性后的包涵体蛋白放入离心管中，4℃保存备用［10-11］。包涵体蛋白的SDS-PAGE分析按文献［9］介绍的方法进行。

1.2.4 α毒素及α毒素D56G突变体蛋白分子二级结构的预测 按照Geourjon介绍的SOPMA法，在EXPASY服务器(http://www.expasy.org/tools)进行预测α毒素和α毒素D56G突变体蛋白分子的二级结构［12］。

1.2.5 α毒素及α毒素D56G突变体蛋白分子3D结构的预测 以蛋白质结构数据库(PDB)解析的A型魏氏梭菌α毒素的三维结晶结构(3D)为模板，利用EXPASY服务器(http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html)同源模型构建α毒素和α毒素D56G突变体蛋白分子的3D结构，并用Rasmol分析软件绘制其3D结构图［13］。

1.2.6 α毒素及α毒素D56G突变体蛋白圆二色光谱分析 采用J810-150S型圆二色(CD)光谱仪，在25℃恒温下，将0.6 mL蛋白溶液(10 μmol/L)置于光径为0.1 cm比色杯中，扫描范围190～250 nm，狭缝宽度1 nm，扫描速度50 nm/min，响应时间2 s，扫描次数3次。测定α毒素和α毒素D56G突变体蛋白的CD光谱并记录数据［10］。

1.2.7 重组菌株BL21(DE3)(pM-D56G)生物学活性的测定 将构建的重组菌株(BL21(DE3)(pMD56G)培养上清、菌体、菌体裂解物和A型魏氏梭菌标准株C57-1的培养上清分别接种卵黄琼脂平板和血琼脂平板上，观察有无磷脂酶C活性和溶血活性［14］。另外，取 3 只 0.5 mL Eppendorf管，各加入100 μL卵黄(含卵磷脂)稀释液，再分别加入100 μL α毒素、α毒素D56G突变体蛋白、生理盐水，混匀后，于37℃孵育24 h，观察是否有浑浊环出现，检测磷脂酶C活性［10］。

取80只小鼠，随机分组，每组20只，分别经口服或腹腔注射5×109个A型魏氏梭菌标准株C57-1和重组菌株(BL21(DE3)(pM-D56G)，观察症状和病理变化［14］。

1.2.8 抗原制备及免疫攻毒试验 重组菌株(BL21(DE3)(pM-D56G)经IPTG诱导4 h后离心收集菌体，然后重悬于5 mL 50 mmol/L Tris-HCl-2 mmol/L EDTA中，加入溶菌酶至终浓度100 μg/mL，再加入5 mL 1%TritonX-100，于30℃温育15 min。超声波处理2个10 s，然后12000 r/min离心15 min，收集的沉淀物即为包涵体粗提物，将其10倍稀释后，加入氢氧化铝胶至10%，作为免疫用抗原［14］。

取160只小鼠，随机分为2组，每组80只，一组用包涵体抗原腹腔免疫0.5 mL/只，另一组用A型魏氏梭菌标准株C57-1类毒素0.5 mL/只，间隔14 d后，以上述方法进行第二次免疫，14 d后进行攻毒试验。同时设立生理盐水对照组。将过夜培养的A型魏氏梭菌标准菌C57-1培养上清作倍比稀释，每个剂量腹腔注射小鼠6只，观察小鼠死亡情况;用1MLD A型魏氏梭菌标准株C57-1培养上清攻击免疫小鼠，观察小鼠存活情况［14］。

2 结果与分析

2.1 α毒素D56G突变基因的扩增与表达质粒pMD56G的构建 利用PCR定点突变技术，扩增出带有突变位点的1.2 kb A型魏氏梭菌α毒素D56G突变体基因，并将其插入到表达载体pET-32a上，构建了含α毒素D56G突变基因表达质粒的重组菌株BL21(DE3)(pM-D56G)。经Nco I/EcoR I、BamH I/EcoR I和Nco I/BamH I/EcoR I酶切鉴定和序列测定，结果表明，构建的重组表达质粒pMD56G含有α毒素D56G突变体基因(图1)，而且编码α毒素第56位Asp的密码子GAT已经突变成编码Gly的密码子GGT，成功地构建了α毒素D56G突变体基因并准确实施了预期的定点突变。

2.2 α毒素D56G突变体基因表达产物的SDSPAGE分析 含A型魏氏梭菌α毒素D56G突变体基因的重组菌株BL21(DE3)(pM-D56G)用IPTG诱导4 h后，SDS-PAGE分析结果表明，α毒素D56G突变体基因在受体菌BL21(DE3)中得到较高水平的表达。经凝胶成像系统扫描分析，重组菌株BL21(DE3)(pM-D56G)中的α毒素D56G突变体蛋白表达量占菌体总蛋白相对含量的22.48%(图2)。

图2 重组菌株BL21(DE3)(pM-D56G)表达产物的SDS-PAGE分析

2.3 α毒素及α毒素D56G突变体蛋白分子二级结构预测 α毒素和α毒素D56G突变体蛋白分子二级结构预测的结果显示，α毒素蛋白含α螺旋118个 (31.9%)、β折叠78个 (21.1%)、β转角44个 (11.9%)、无规则卷曲130个 (35.1%)，α毒素D56G突变体含α螺旋118个 (31.89%)、β折叠78个 (21.08%)、β转角46个 (12.43%)、无规则卷曲128个 (34.60%)(图3)。从预测的α毒素及α毒素D56G突变体蛋白分子的二级结构结果来看，二者的二级结构除第56突变位点由无规则卷曲变成β转角和第55位由无规则卷曲变成β转角外，其余的二级结构没有发生变化，说明α毒素和α毒素D56G突变体蛋白分子的二级结构基本一致。

2.4 α毒素及α毒素D56G突变体蛋白分子3D结构预测 α毒素和α毒素D56G突变体蛋白分子3D结构的预测结果显示，α毒素一共有10段α螺旋，8段β折叠，而α毒素D56G突变体蛋白的3D结构与α毒素的3D结构相似(图4)。

2.5 α毒素及α毒素D56G突变体蛋白分子的圆二色光谱分析 圆二色(CD)光谱仪测定了α毒素及α毒素D56G突变体蛋白分子的CD光谱，结果显示，α毒素分别在207 nm和209 nm处有一个凹峰，而α毒素D56G突变体蛋白则没有(图5 A、B，表1)。

图3 α毒素和α毒素D56G突变体蛋白分子的二级结构预测及比较

图4 α毒素(A)和α毒素D56G突变体蛋白(B)分子3D结构预测

图5 α毒素(A)及α毒素D56G突变体蛋白(B)的圆二色谱图

表1 圆二色谱测定α毒素和α毒素D56G突变体蛋白二级结构成分比较

2.6 重组菌株BL21(DE3)(pM-D56G)生物学活性的测定 将重组菌株BL21(DE3)(pM-D56G)的培养上清、菌体培养物及菌体裂解物涂布于卵黄琼脂平板上，结果重组菌株的培养上清、菌体培养物、菌体裂解物均没有出现浑浊环，表明α毒素D56G突变体蛋白没有磷脂酶C活性，而对照组的A型魏氏梭菌标准株C57-1培养上清在卵黄琼脂平板上出现了浑浊环，这说明重组菌株BL21(DE3)(pM-D56G)不具备α毒素的磷脂酶C活性。磷脂酶C活性检测结果如图6所示:1号管出现浑浊环，而2号和3号管均未出现浑浊环。结果说明2号管α毒素D56G突变体蛋白和3号管生理盐水均不能分解卵黄中的卵磷脂，故不具有磷脂酶C活性;1号管α毒素出现浑浊环，说明α毒素能分解卵黄中的卵磷脂，具有磷脂酶C活性。上述试验结果证实，重组菌株BL21(DE3)(pM-D56G)表达的α毒素D56G突变体蛋白已经丧失了α毒素的磷脂酶C活性。

图6 磷脂酶C活性检测结果

将重组菌株BL21(DE3)(pM-D56G)的培养上清、菌体培养物、菌体裂解物涂布于血琼脂平板上，结果重组菌株的培养上清、菌体培养物、菌体裂解物均没有出现溶血环，表明α毒素D56G突变体蛋白没有溶血作用，而阳性对照组的A型产气荚膜梭菌标准株C57-1培养上清在血琼脂平板上出现了溶血环，阴性对照组的BL21(DE3)(pET-32a)培养上清在血琼脂平板上没有出现溶血环，这说明重组菌株BL21(DE3)(pM-D56G)不具备α毒素的溶血活性。另外，经腹腔注射或口服两种途径接种重组菌株BL21(DE3)(pM-D56G)3周后，小鼠全部存活且无异常表现，剖检观察无病理变化，表明该菌株丧失了α毒素毒性和致病性;而A型魏氏梭菌标准株C57-1阳性对照组则出现典型的临床症状和病理变化，BL21(DE3)(pET-32a)阴性对照组则无任何变化。

2.7 免疫攻毒试验 免疫攻毒试验结果表明，重组菌株BL21(DE3)(pM-D56G)包涵体抗原免疫组保护率为92.5%(74/80)，A型魏氏梭菌标准株C57-1类毒素抗原免疫组保护率为95%(76/80)，而生理盐水对照组20只小鼠全部死亡，这说明构建的α毒素D56G突变体蛋白具有较好的免疫保护效果。

3 讨论

A型魏氏梭菌的主要致病因子是菌体产生的α毒素，由于α毒素能水解卵磷脂的C链，产生磷酰胆碱和甘油二脂，故又称为磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)。

α毒素的某些氨基酸组成对其生物学活性有着重要的影响，其中个别氨基酸对其生物活性起着十分重要作用。Nagaham等［15］利用定点突变技术，研究了组氨酸残基在α毒素中的作用，他们将第68位组氨酸残基(His)突变成甘氨酸残基(Gly)，结果突变的α毒素完全丧失了α毒素本身的磷脂酶C活性、鞘磷脂酶活性和溶血活性。如果将第126位、136位His突变成Gly，结果突变的α毒素活性比天然α毒素活性下降100倍。Guillouard等［16］将α毒素第56位Asp突变成 Asn，Nagahama等［17］将第56 位的 Asp 突变成 Ser、Asn、Glu 或 Gln，结果都证实这些α毒素突变体完全丧失了α毒素的溶血性和PLC活性。研究还表明，第56位的Asp是α毒素活性的催化位点，第130位Asn是α毒素活性的结合位点。另外该研究小组还研究了α毒素氨基端酶活位点附近57和65位Tyr的作用，将以上位点用Ala、Leu或Phe突变后，没有影响鞘磷脂酶的活性。然而将两个突变体毒素结合到脂质体上，并用环境敏感荧光基团标记后追踪，发现其存在于双分子层疏水区，说明第57位和第65位的Tyr在α毒素渗透进双分子膜和鞘磷脂催化位点过程中起着重要作用，但不参与酶活反应［18］。上述研究都说明α毒素的某些氨基酸残基对其生物学活性至关重要，但都尚未开展α毒素突变体分子结构的研究。

本研究选择α毒素磷脂酶C上锌离子的结合位点第56位天冬氨酸(Asp-56)进行定点突变，构建了在大肠杆菌中较高水平表达的α毒素D56G突变体基因，并测定了α毒素D56G突变体蛋白的二级结构、3D结构和圆二色(CD)光谱，同时检测了其生物学活性，进而探讨了α毒素突变前后分子结构和生物学活性的变化，结果表明突变前后α毒素的二级结构和CD光谱都发生了变化，但却具有免疫原性，这为进一步研究α毒素的分子结构与生物学功能的关系奠定了基础，同时为下一步研制α毒素基因工程亚单位疫苗提供了候选基因工程菌株。

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