长春市市售猪肉鸡肉中金黄色葡萄球菌和沙门氏菌分离及耐药性分析

王 莹，陈 萍，王佳男，冯书章，郭学军

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，长春130118；2.解放军军事医学科学院军事兽医研究所，长春130122）

金黄色葡萄球菌和沙门氏菌是我国食品卫生标准中食品卫生微生物常规检测项目，是常见食物中毒致病菌。在我国的细菌性食物中毒事件中，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占四分之一，居于第四位，由沙门氏菌引起的食物中毒屡居首位［1］。近年来，耐药性沙门氏菌和金黄色葡萄球菌开始出现，并呈现上升趋势［2-3］。据统计，中国病原菌耐药性增长率在全世界是最快的［4］。在畜禽上抗生素的大量使用或滥用，在抗生素选择性压力下，不仅会造成致病菌对抗菌类药物耐药性和交叉耐药的产生，而且有研究表明抗生素治疗可能会延长感染动物病情［5］。控制动物源性细菌耐药性的产生及传播是解决人类日益严重耐药性问题的重要环节。目前，左旋氧氟沙星（氟喹诺酮类抗生素）、头孢类药物（β-内酰胺类抗生素）和庆大霉素（氨基糖苷类抗生素）是国内临床治疗沙门氏菌或葡萄球菌感染的一线药物，四环素（四环素类抗生素）为畜禽饲喂过程中常用药物。

自2013年6月到2014年3月对吉林省长春市超市及农贸市场中生鲜鸡肉、猪肉进行沙门氏菌和金黄色葡萄球菌分离鉴定及耐药性分析，以期为进一步对食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行风险评估奠定科学基础。

1 材料与方法

1.1 培养基和试剂 SC增菌液（20130918）、XLD培养基（20121107）、BS 培养基（20130516）、BP 培养基（20121126）、M-H 培养基（20120610）、蛋白胨（20120816），购自北京奥博星生物技术有限责任公司；磷酸二氢钠（20111118）、磷酸氢二钠（20130107）、氯化钠（20120910），购自北京化工厂；dNTPs、DNAMarker，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；Taq酶（2000U）购自长春鼎国生物工程技术有限公司。

1.2 抗生素 头孢噻肟钠（CefotaximeSodium，CEX）、左旋氧氟沙星（Levofloxacin，LVX）、庆大霉素（Gentamicin，GEN）、四环素（Tetracycline，TET），购自长春鼎国生物工程技术有限公司。其中庆大霉素含量为 694 μg／mg，其余抗生素含量均为＞900 μg／mg。

1.3 质控菌株 大肠杆菌（ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC29213），购自吉林省检验院。

1.4 金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的分离 分别按GB 4789.10-2010和GB 4789.4-2010从市售的猪肉、鸡肉分离金黄色葡萄球菌和沙门氏菌。

1.5 金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的鉴定 采用PCR方法代替传统的生化方法对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌分离株进行鉴定，使用引物invA对沙门氏菌进行鉴定，引物nuc对金黄色葡萄球菌进行鉴定，引物序列见表1。

表1 引物序列及PCR产物

1.6 药敏试验 按照 SN／T 1944—2007［6］制作药敏纸片，进行药敏试验，按照 CLSI2010［7］对药敏结果进行判定。

2 结果与分析

2.1 肉品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌污染情况

按照国标方法从样品中分离金黄色葡萄球菌和沙门氏菌，金黄色葡萄球菌总检出率为46%（46／100），鸡肉中检出率为 44.29%（31／70）；猪肉中检出率为 50%（15／30）。沙门氏菌总检出率为16.84%（48／285），鸡肉中检出率为 21%（42／200）；猪肉中检出率为7.06%（6／85），结果如表2所示。

表2 金黄色葡萄球菌和沙门氏菌分离情况

2.2 肉品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌耐药率结果 利用K-B法检测分离到的金黄色葡萄球菌和沙门氏菌对4种抗生素的耐药性。试验结果表明，金黄色葡萄球菌对左旋氧氟沙星的耐药率为56.52%（26／46）最为普遍，其次为四环素50%（23／46），对头孢噻肟钠耐药率较低，为 8.7%（4／46）。所有菌株均对庆大霉素敏感，耐药率为0。猪肉和鸡肉中分离到的金黄色葡萄球菌均对头孢噻肟钠、左旋氧氟沙星和四环素具有耐药性（表3）。鸡肉中金黄色葡萄球菌菌株对四环素、左旋氧氟沙星的耐药率高于50%，对头孢噻肟钠耐药率为9.68%；猪肉中金黄色葡萄球菌菌株对四环素、左旋氧氟沙星均低于50%，对头孢噻肟钠耐药率仅为6.67%。

表3 金黄色葡萄球菌耐药性检测结果

试验中分离到的48株沙门氏菌对各种抗生素的耐药率在16.67%～87.5%之间。其中对四环素耐药率最高，为87.5%（42／48）。沙门氏菌对四种抗生素总耐药率依次为四环素（87.5%）＞庆大霉素（54.17%）＞头孢噻肟钠（25%）＞左旋氧氟沙星（16.67%）（表4）。鸡肉中沙门氏菌菌株对四环素和庆大霉素的耐药率高于50%，对头孢噻肟钠和左旋氧氟沙星的耐药率均低于30%；猪肉中沙门氏菌菌株四环素耐药率高达100%，庆大霉素耐药率为50%，对左旋氧氟沙星耐药率为16.67%，对头孢噻肟钠敏感率为100%。

表4 沙门氏菌药耐药性检测结果

2.3 肉品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌多重耐药结果

2.3.1 金黄色葡萄球菌多重耐药结果 金黄色葡萄球菌对4种抗生素共产生了6种耐药谱。优势耐药谱为LVX、TET和LVX-TET谱型。大部分菌株具有耐药性，分离株耐药率达到78.26%，耐药谱显示金黄色葡萄球菌对四环素和左旋氧氟沙星耐药较高。经过多重耐药分析发现，金黄色葡萄球菌有10株对4种抗生素完全敏感，22株仅对其中的1种抗生素耐药，14株对2种抗生素耐药，2株对3种抗生素耐药，多重耐药率为4.35%（2／46）（表5）。

表5 金黄色葡萄球菌多重耐药及耐药谱结果

2.3.2 沙门氏菌多重耐药结果 试验中分离到的48株沙门氏菌对4种抗生素产生9种耐药谱，相对优势谱型为 GEN-TET、CEX-GEN-TET和CEXGEN-LVX-TET。本研究中沙门氏菌分离株耐药率达到93.75%，29株（60.41%）对2种以上抗生素具有耐药性，12株（25%）对至少3种抗生素具有耐药性。沙门氏菌有3株对4种抗生素均敏感，16株仅对1种抗生素耐药，17株对2种抗生素耐药，7株对3种抗生素耐药，5株对所用4种抗生素均有耐药性（表6）。

表6 沙门氏菌多重耐药及耐药谱

3 讨论

致病菌的污染会发生在处理、加工、包装及分配各个环节中，鸡肉分割期间肠道破裂，肉品销售场所卫生环境恶劣等均会导致污染。本试验结果显示，自2013年6月到2014年3月采集的猪肉和鸡肉样品中，金黄色葡萄球菌检出率为46%，沙门氏菌检出率为16.84%。于宏伟［8］等鸡肉中金黄色葡萄球菌的检出率为44.83%，猪肉中金黄色葡萄球菌的检出率仅为19.77%。张芳［9］等报道2772份食品样品中沙门氏菌在各类食品中的检出率为9.15%。李秀桂［10］等对广西生畜肉食源性沙门氏菌污染检测分析结果为 12.5%～45.83%，生禽肉6.25%～31.25%。以上报道均表明我国的各类市售畜禽肉类均存在病原菌的污染现象。

近年来，耐药性的出现及耐药率的持续上升，给临床预防和治疗沙门氏菌感染带来很大挑战。本试验对获得的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行药敏试验，结果表明金黄色葡萄球菌对氟喹诺酮类药物和四环素类药物的耐药率偏高，分别达到56.25%和50%，对头孢噻肟钠耐药率虽然相对较低，也应对其给予重视；沙门氏菌对4种抗生素均呈现不同程度的耐药性，对四环素耐药率达到87.5%。略低于王文侠［11］等报道的贵阳市鸡肉分离的沙门氏菌对头孢噻肟钠、氧氟沙星、庆大霉素、四环素耐药率，分别为 71.4%、42.9%、78.5%、100%；与吴云凤［12］等报道结果相似。总体看来，本研究中来源于鸡肉中的金黄色葡萄球菌和沙门氏菌耐药率高于来源于猪肉中的菌株。这可能是因为我国家禽规模化饲养较早，与抗生素长期作为鸡饲料添加剂被用于预防疾病和生长促进剂有关。细菌耐药性多为获得性耐药，畜禽饲喂过程中抗生素的不合理使用会导致细菌耐药性的产生。经多次无抗生素压力传代，部分耐药性会逐渐消失，所以在畜禽饲喂过程中应合理使用抗生素，不宜持续使用同一类抗生素。

值得关注的是，试验中分离到的金黄色葡萄球菌和沙门氏菌均存在多重耐药性。4.35%的金黄色葡萄球菌对3种抗生素具有耐药性，25%的沙门氏菌对3种及3种以上抗生素具有耐药性。国内还有许多对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌多重耐药性的报道。徐本锦［13］等报道金黄色葡萄球菌多重耐率达到88.52%。张秀丽［14］等对河南省生鸡肉分离的沙门氏菌进行耐药研究，58.5%对3种以上抗生素具有耐药性。邹立扣［15］等对18株猪肉中分离的沙门氏菌进行药敏试验，27.78%对3种以上抗生素具有耐药性。可见，国内金黄色葡萄球菌和沙门氏菌多重耐药现象普遍。报道结果的不同可能是因为采样数量、采样地区和所选用抗生素种类的差异造成的。随着抗生素耐药性的进一步加剧，很多致病菌已经产生了严重的多重耐药现象。人一旦感染多重耐药菌，临床治愈难度会增大。

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