磷酸化高分子量神经微丝蛋白在脊髓损伤评定中的研究进展

何件根 武 亮

北京小汤山医院康复中心，北京 102211

脊髓损伤导致的感觉和运动功能的缺失，不仅是由原发性损伤引起，同时各种原因引起的继发性损伤也会导致脊髓神经功能的进一步缺失，这其中包括炎性反应、缺氧及毒素等导致的迟发型神经元及胶质细胞的凋亡、轴突退化等[1-2]。科学家及医务工作者们一致认为应该在脊髓损伤的早期而不是慢性期进行治疗干预[3-4]，他们致力于寻找更多有效的方法来防止继发性损伤导致的神经组织损伤、神经组织及其功能重建，因此，在脊髓损伤的早期很多药物及组织工程方法被应用于治疗干预[5]。 但是，在研究过程中发现脊髓损伤早期的治疗效果很难评价，主要是因为脊髓休克期的存在[5-6]，脊髓损伤的基础损伤严重程度很难评价。

1 传统的脊髓损伤评价方法

目前脊髓损伤的评价方法主要有神经功能学评价、影像学评价、神经电生理检查、组织形态学观察等[7-9]。 目前在临床中应用的神经功能学评价方法主要为ASIA 评价方法[10]，在动物实验中应用的主要为BBB 评分，但在脊髓损伤休克期神经功能检查结果并不能真实反映脊髓的神经功能状况[11-12]。 对于认知功能有问题及不能很好配合检查的儿童也不能完成神经功能检查。 脊髓损伤后影像学检查主要包括X 线、CT、MRI，X 线和CT 并不能清晰反映脊髓等软组织的结构状况，主要是用于评价骨性结构的连续性及完整性，MRI 被认为是脊髓损伤诊断的“金标准”，但在超急性期MRI 不能良好地显示脊髓的损伤状况，早期患者不宜于大幅度移动也限制了MRI 在脊髓损伤中的实时追踪，而且对于一些体内存在磁性金属物质如枪伤的患者不适于行MRI 检查[13-14]。 神经电生理检查主要包括体感诱发电位（SEP）、动作诱发电位（MEP）、肌电图（EMG）[15]，此方法操作较简单，但是干扰因素太多，且MEP 在脊髓损伤休克期也不能做出评估，也无分级标准[9]。 组织形态学[16]广泛应用于动物实验中，但临床中无法应用。 还有一些不常用的评定方法，如脊髓血流量测定法[17]、神经束路示踪法[18]等，目前只是偶尔用于动物实验。

2 分子标志物在脊髓损伤领域研究的状况

基于在脊髓损伤休克期传统方法不能完全评价脊髓损伤状况，研究者开始考虑是不是可以在微观水平寻找一项指标来评价脊髓损伤休克期的脊髓原发性及继发性损伤严重程度，因此，分子标志物的研究逐渐受到重视。 目前研究的分子标志物主要有小分子量的钙结合蛋白S100、神经元特异性烯醇酶（NSE）及神经微丝蛋白（NF）。 有研究显示S100 及NSE 不仅存在于神经细胞中，在其他非神经细胞也检测到他们的存在[19]。大量研究发现，血清中S100 及NSE在脊髓损伤后6 h 达高峰，24 h 降至基线水平，这是因为S100 及NSE 稳定性较差，容易被蛋白酶水解[20-22]。而NF 只存在于神经细胞当中，神经细胞特异性强，并且有很强的抗酶解能力，特别是磷酸化的神经微丝蛋白（pNF）抗酶解能力更强。 NF 存在3 种亚结构，分别为低分子量的神经微丝蛋白（NF-L）、中分子量的神经微丝蛋白（NF-M）以及高分子量的神经微丝蛋白（NF-H），在神经细胞的分子标志物当中NF-H 含量最高，NF-L、NF-M 及其他分子标志物含量均较低[23]，因此磷酸化的高分子量神经微丝蛋白（pNF-H）无疑是评价脊髓损伤很有前景的一项指标。

3 pNF-H 的研究

早在20 世纪80 年代，Lee 等[24]就曾做过NF 的蛋白序列研究，发现NF 蛋白中存在许多赖氨酸-丝氨酸-脯氨酸多肽重复序列，且为磷酸化的活性状态，这种结构使得NF具有很强的抗钙蛋白及其他水解酶的能力。

3.1 pNF-H 在脊髓损伤动物模型的首次研究

由于pNF-H 具有中枢神经细胞特异性强、含量高、稳定性强、标本采集方便等特性，有学者就假设是否可以通过某种方法测定血清当中的pNF-H 含量来评估神经细胞退化及凋亡情况从而评估脊髓损伤的严重程度及脊髓损伤的进展过程。 2005 年Shaw 等[25]为验证这一假设设计了一项动物实验，对照组单纯行T11椎板切除，实验组1 采用NYU 打击器10 g 的滑棒在25 mm 高度下造成大鼠T11脊髓挫伤模型，实验组2 采用手术刀造成大鼠脊髓T11半切的横断性损伤，分别在术前、术后1 h、2 h、4 h、6 h、12 h、16 h、24 h、2 d、3 d、4 d、5 d、7 d、14 d 采集血样，采用ELISA 方法进行测定，实验结果显示，在术前及对照组的血清中未检测到pNF-H，在实验组1 及实验组2 的术后血样中发现，手术刚开始的几小时便出现pNF-H 溶度的上升，术后16 h 时出现第1 次溶度高峰，之后pNF-H 溶度下降，在术后3 d 出现溶度最高峰，之后数天内pNF-H 溶度缓慢降低直至检测不到。Shaw 等[25]指出，由于NF 只存在于神经细胞当中，NF 在血清中出现毫无疑问说明神经细胞的破坏，实验组血样pNF-H 双峰溶度结构考虑为脊髓的原发性损伤于继发性损伤所致，但这一推测需要进一步的实验来证实。

3.2 pNF-H 测定在脊髓损伤动物模型的验证性研究

基于Shaw 等[25]只是展示了脊髓损伤后血清中pNF-H出现双峰现象，但这一双峰现象或者说pNF-H 溶度变化是一种与脊髓损伤程度无关的、独立的反应过程还是与脊髓损伤程度相一致尚且未知。 为此，2011 年Ueno 等[26]进行了一项动物实验来阐述这一问题，将T10中度挫伤的SD 大鼠随机分成两组，对照组给予生理盐水腹腔注射，实验组给予二甲胺四环素腹腔注射，注射频率为2 次/d，持续注射3 d，分别于注射后1、2、3、4 d 采集尾静脉血， 离心后收集血清进行ELISA 检测pNF-H 水平，在1、3、7、14、21、28 d 进行BBB 大鼠行为学评分。 BBB 结果进行U 检验，两组间血清pNF-H 结果进行重复测量方差分析，BBB 结果与pNF-H 结果进行相关性分析。 结果显示在注射3 d 后，四环素组pNF-H 开始较生理盐水组降低，但统计发现差异无统计学意义，BBB 与pNF-H 呈负相关，考虑因为血样采集时间过短，四环素的神经保护作用尚未完全表现出来，所以四环素组pNF-H 与生理盐水组无统计学差异。 文献资料显示四环素对脊髓损伤的治疗效果一般在注射后7 d和14 d 能表现出来， 作者最后总结pNF-H 能够评定脊髓损伤3 d内神经保护剂的神经保护作用。上述实验结果显示pNF-H在大鼠的脊髓损伤程度的评价中能够起到指导性作用。

2014 年Nishida 等[27]进行了更加大型动物的实验研究，他们采用动物是居民捐赠的狗进行实验，6 只对照组，60只实验组，采用神经功能学分类方法进行评价，通过CT 和脊髓X 射线摄影诊断狗为脊髓损伤，且行减压术时确诊，实验结果显示grade 5 组的pNF-H 比grade 4 明显，grade 5组中，pNF-H 水平很高的（平均4496 pg/mL）的狗没有下肢活动，而pNF-H 水平不算高（平均173 pg/mL）的下肢出现活动，同时grade 4 组中（pNF-H 126 pg/mL）狗的下肢能动，pNF-H 水平随时间变化（第1、2、3 天）差异不显著，grade 5 组显示pNF-H 水平与预后存在相关性，cutoff 分析显示最高值存在100.0%的特异性及34.8%的敏感性。实验一定程度上证实pNF-H 在大型哺乳动物的脊髓损伤程度在评价中也可行。

3.3 pNF-H 测定在脊髓损伤的临床研究

pNF-H 对脑外伤、脑出血、肌萎缩侧索硬化症等疾病的评价已经从动物实验研究走向临床实验研究，而pNF-H在临床实验中将会取得怎样的结果呢？ Hayakawa 等[7]在2012 年进行了一项包括14 例患者的临床实验。 病例为颈段脊髓损伤12 h 以内的患者，病例跟踪随访至少30 d，分别于伤后6 h、12 h、18 h、24 h、48 h、72 h、96 h、6 d、8 d、10 d、14 d、21 d 采集静脉血，采用ELISA 方法测定血清pNF-H水平，在伤后12 h、7 d、30 d 进行脊髓损伤水平（ASIA）评分。 结果显示ASIA 组的pNF-H 从伤后12 h 开始上升一直到伤后96 h；ASIA A 组的pNF-H 水平较ASIA C～E 组高且差异有统计学意义；ASIA C 组的pNF-H 水平较ASIA D 组高但差异没有统计学意义；其中ASIA E 组中，1 例中央管综合征患者的pNF-H 水平很高，但症状很轻，并且9 个月的随访结果显示症状痊愈。 Hayakawa 等[7]总结虽然实验还存在或多或少的不足，但是从这当中看到pNF-H 在临床中评价脊髓损伤严重程度及病变过程可能还需要更多研究来证实。

4 展望

目前pNF-H 在脊髓损伤方面的研究还都是初级阶段的实验性研究，这其中存在实验样本量小、实验周期过短、评价方法单一、缺乏有效对照性、实验尚缺乏有力证据的结论等不足，这需要研究者们在动物实验和临床实验中做出更多的工作，但pNF-H 作为神经细胞中含量最高的生物标志物，具有不较其他标志物的生物活性稳定、生物特异性强等优点[28]，将会有更多关于pNF-H 在脊髓损伤的动物实验领域及临床领域的研究，pNF-H 将可为脊髓损伤后用药指导及治疗效果的实时追踪提供参考，并在脊髓损伤的研究中越走越远。

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