17—AAG对人肝癌HepG2细胞株增殖和凋亡作用的影响

陈美霓+郭巍（等）

[摘要] 目的 观察17-AAG对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响并探讨其机制。 方法 四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测不同浓度的17-AAG对肝癌HepG2细胞增殖的影响；荧光显微镜观察碘化丙啶（PI）染色的细胞凋亡形态；流式细胞仪检测分析细胞周期分布和凋亡率的变化；免疫组化法检测肝癌HepG2细胞中重组人血管内皮生长因子相关蛋白（VEGF-C蛋白）表达水平变化。 结果 不同浓度的17-AAG呈时间、剂量依赖性抑制肝癌HepG2细胞的生长增殖（P < 0.05）；流式细胞仪分析显示，17-AAG作用HepG2细胞48 h后G2/M期细胞比例上升，G1/G0期细胞比例下降；0.63、1.25、2.5、5.0 μmol/L 17-AAG作用HepG2细胞48 h后的凋亡率分别为（3.23±1.43）%、（9.71±2.20）%、（14.15±2.34）%、（23.65±2.58）%；随着药物浓度的加大，VEGF-C蛋白表达逐渐减少。 结论 17-AAG对肝癌HepG2细胞有抑制增殖、诱导凋亡的作用，并能抑制VEGF-C蛋白的表达。

[关键词] 热休克蛋白90；17-AAG；肝细胞癌；MTT法

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）10（c）-0012-04

Effects of 17-AAG on proliferation and apoptosis of human hepatoma carcinoma cell lines HepG2

CHEN Meini1 GUO Wei2▲ ZHAO Jumei1 WEI Xiaoli1 WANG Aihong1 PANG Qiuxia1

1.Center of Medical Experiment， Medical College of Yan′an University， Shaanxi Province， Yan′an 716000， China； 2.Department of Urology Surgery， the Affiliated Hospital of Medical College of Yan′an University， Shaanxi Province， Yan′an 716000， China

[Abstract] Objective To study the effect of 17-allylamino-17-demethoxygelda-namycin （17-AAG） on cell proliferation and apoptosis in human hepatoma carcinoma cell lines HepG2 and analyze the possible mechanism. Methods The human hepatoma carcinoma cell lines HepG2 cells were treated with different concentrations of 17-AAG in vitro， the cell proliferation was analyzed by the MTT； the cell apoptosis changes was observed using PI dyeing under the fluorescence microscope； the effect of 17-AAG on apoptosis and cell cycle were assayed through flow cytometry； the expression of VEGF-C protein was detected by immunohistochemistry. Results 17-AAG significantly suppressed the proliferation of HepG2 cells in a time and dose-dependent manner （P < 0.05）. Flow cytometry analysis showed that 17-AAG could increase the cell population in G2/M phase and reduce the cell population in G1/G0 phase at 48 h. HepG2 cells were treated with 17-AAG of 0.63， 1.25， 2.5 and 5.0 μmol/L concentrations for 48 h， the apoptosis rate were （3.23±1.43）%， （9.71±2.20）%， （14.15±2.34）% and （23.65±2.58）%. The expression of VEGF-C protein was reduced with the increase of drug concentration. Conclusion 17-AAG can inhibit proliferation and induce apoptosis of HepG2 cells， and can decrease the expression of VEGF-C protein.

[Key words] HSP90； 17-AAG； Hepatocellular carcinoma； MTT

原发性肝细胞癌是全球第5位常见恶性肿瘤，其病死率占恶性肿瘤病死率的第3位。据2008年的报道，中国肝癌5年患病数为29.6万例，约占全球肝癌5年患病数的48.3%。在未来10年肝癌的发病数和病死数均将呈现上升趋势。采用手术切除等治愈方法仅适合10%～20%的肝癌患者，在5年内复发率仍超过70%[1]。所以寻找以肿瘤细胞特性为作用靶点的分子靶向治疗有着特别重要的意义。HSP90抑制剂17-丙烯胺基-17-去甲氧格尔德霉素（17-AAG）对多种肿瘤细胞有抑制增殖、诱导凋亡的作用，但目前尚未见17-AAG对肝癌细胞生长及凋亡影响的报道，本文探讨17-AAG对HepG2细胞增殖、生长周期、诱导凋亡及对重组人血管内皮生长因子相关蛋白（VEGF-C）的表达进行初步探讨，为17-AAG治疗肝癌的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人肝癌细胞株HepG2由延安大学医学院实验中心提供。RPMI-1640培养基（赛默飞世尔公司），17-AAG、四甲基偶氮唑蓝（MTT）及碘化丙啶（PI）（美国Sigma公司）AnnexinV FITC细胞凋亡检测试剂盒（美国BD pharmingen公司），RNase A酶（德国Merck公司），胎牛血清（美国Hyclone公司），兔抗人VEGF-C蛋白、兔二抗及DAB显色剂（武汉博士德公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 取液氮保存的人肝癌HepG2细胞在37℃恒温水浴箱中快速复苏，接种于内含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中常规培养，选取对数生长期细胞用于实验研究。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖能力 选取对数生长期的人肝癌HepG2细胞用0.25%胰蛋白酶消化，加完全培养液制成单细胞悬液，以每孔为3×103个细胞接种于96孔培养板中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。培养24 h后弃上清液，设无细胞孔作为空白组，不加药孔为对照组，实验组17-AAG浓度为0.63、1.25、2.5、5.0 μmol/L，每组设5个平行孔。分别温育24、48、72 h后，每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，培养4 h，吸净上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），振荡10 min，使用酶标仪测定波长为490 nm处的吸光度值，空白组调零。细胞增殖抑制率（%）=（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值×100%。以上实验结果重复3次。

1.2.3 PI染色观察细胞核形态 人肝癌HepG2细胞接种于内有重铬酸钾处理过的盖玻片的24孔板内培养。在细胞对数生长期时设对照组和实验组培养48 h后终止，去上清液，用PBS洗涤3次，用50 μg/mL的PI荧光染液在4℃冰箱中避光染色20 min后，夹出盖玻片盖在载玻片上，用荧光显微镜观察细胞核形态并拍照。

1.2.4 流式细胞仪分析 取对数生长期的人肝癌HepG2细胞接种于6孔板内培养，设实验组和对照组，培养48 h后胰酶消化，用磷酸盐缓冲液（PBS）离心洗涤2次。①细胞周期：预冷70%酒精固定，4℃过夜，离心，弃去固定液，然后加入PBS含50 μg/mL的PI，100 μg/mL RNase A酶，0.2%Triton X-100染色液，微量振荡器上振荡混匀，4℃避光孵育30 min，200目不锈钢筛网过滤后流式细胞仪检测。②细胞凋亡：严格按照AnnexinV FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书步骤进行。两个实验重复3次。

1.2.5 VEGF-C蛋白表达的检测 将人肝癌HepG2细胞接种于内有盖玻片的6孔板内培养培养，设对照组和实验组培养48 h后，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤3次，用中性树胶将细胞面朝上固定于载玻片上，采用免疫组化链霉亲和素-生物素复合物（SABC）法染色，胰酶抗原修复，二氨基联苯胺（DAB）显色。兔抗人VEGF-C稀释比例为1∶100，以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判断：细胞胞浆出现棕黄色颗粒判断为阳性细胞，按照Fromowit等综合计分法在高倍镜下对染色细胞着色反应作结果判定。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，行t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 17-AAG对人肝癌HepG2细胞生长的抑制作用

MTT测定结果显示，分别以0.63、1.25、2.5、5.0 μmol/L 4个浓度的17-AAG作用于人肝癌HepG2细胞24、48、72 h后，HepG2细胞均有不同程度的抑制生长作用，各实验组增殖抑制率与对照组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。其抑制作用经方差分析，具有剂量和时间依赖关系，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

表1 不同浓度的17-AAG对人肝癌HepG2细胞生长的抑制率（%，x±s）

注：与对照组比较，#P < 0.05；17-AAG：17-丙烯胺基-17-去甲氧格尔德霉素

2.2 PI染色观察凋亡细胞核形态变化

荧光显微镜下观察17-AAG不同浓度组48 h后PI染色下HepG2细胞的形态变化（图1）。镜下细胞核呈红色荧光，对照组HepG2细胞形态完整，细胞核大小一致，着色均匀；实验组可见HepG2细胞体积变小，细胞核固缩，呈浓缩强荧光，并随药物浓度升高，细胞数下降，凋亡小体逐渐增多。

A：对照组；B：0.63 μmol/L组；C：1.25 μmol/L组；D：2.5 μmol/L组；E：5.0 μmol/L组

图1 荧光显微镜下HepG2的细胞核染色质的形态变化

（PI荧光染色，100×）

2.3 17-AAG对HepG2细胞周期和凋亡的影响

流式细胞术分析显示，HepG2细胞在17-AAG 48 h作用下，随药物浓度的增加，G2/M期的细胞比例增加，提示17-AAG能使HepG2细胞阻滞在G2/M期，PI染色法检测细胞周期分析结果显示，经17-AAG作用48 h后，不同浓度的17-AAG均能使细胞被阻滞在G2/M期。细胞周期阻滞作用亦随药物浓度增加而升高。肝癌HepG2细胞凋亡率随着药物浓度的增加明显高于对照组细胞，与对照组比较差异有统计学意（P < 0.05）。见表2。

表2 17-AAG对人肝癌HepG2细胞周期和凋亡率的影响（%，x±s）

注：与对照组比较，#P < 0.05；17-AAG：17-丙烯胺基-17-去甲氧格尔德霉素

2.4 免疫细胞化学染色法检测VEGF-C蛋白表达结果

免疫组织化学结果显示，对照组HepG2细胞VEGF-C蛋白呈强阳性表达，棕黄色颗粒多，阳性细胞表达率高，见图2A。17-AAG作用HepG2细胞48 h后，加药细胞VEGF-C蛋白与对照组比较，随着17-AAG浓度的增加，表达率及表达量呈逐渐降低趋势。见图2B～E。

A：对照组；B：0.63 μmol/L组；C：1.25 μmol/L组；D：2.5 μmol/L组；E：5.0 μmol/L组；17-AAG：17-丙烯胺基-17-去甲氧格尔德霉素；VEGF-C：重组人血管内皮生长因子相关蛋白

图2 17-AAG处理HepG2 48 h后VEGF-C表达的影响（400×）

3 讨论

肝癌是严重威胁着全球人类生命健康的疾病之一。近几年，随着肿瘤分子生物学研究的深入，分子靶向药物已在多种肿瘤中进行广泛研究和应用。HSP90是一种高度保守的具有特殊分子伴侣的功能蛋白。HSP90可以调节下游服务蛋白的稳定性[2]。还参与多重信号通路的调控以及细胞周期进程，在致癌信号的传导、血管的新生、抗细胞凋亡以及肿瘤转移等方面有着重要的作用[3]。抑制HSP90可以消耗下游服务蛋白以及影响致癌的途径，促进凋亡的发挥和抗肿瘤的效应[4]。实验证实，HSP90抑制剂17-AAG对白血病[5]、乳腺癌[6]、多发性骨髓瘤[7]、前列腺癌[8]等肿瘤有治疗活性，并与多数细胞毒试剂、蛋白酶体抑制剂、组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂和新型靶向药物联用具有协同或增强的效果[9]。17-AAG通过与ATP特异性竞争ATP/ADP位点，使HSP90构象改变导致效应蛋白失活，从而发挥其抑制生长，促进凋亡的作用[10]。17-AAG还可诱导Flt3-ITD的降解[11]，对有Flt3-ITD的突变AML患者有望改善其预后。实验MTT结果表明，HSP90抑制剂17-AAG对肝癌HepG2细胞有抑制生长的作用，抑制作用随着作用时间、药物浓度的增加而增强。通过PI荧光染色，观察到17-AAG作用过的HepG2细胞数减少，细胞核着色由大小均一变成体积小而深，并出现凋亡小体，提示17-AAG对HepG2细胞有抑制增殖并诱导凋亡的作用。本次试验通过细胞流式检测，提示17-AAG的体外抑制可能与阻滞HepG2细胞在G2/M期，并促进凋亡有关。

血管内皮生长因子（VEGF）具有促进恶性肿瘤的增殖、侵袭和转移的作用。VEGF-C是VEGF家族中最早被发现的促淋巴管生成因子，与其受体VEGFR-3结合后促进淋巴管内皮细胞的生长，主要为三条通路：①VEGF-3胞内的区酪氨酸Y1230/Y1231，发生自磷酸化、被识别、结合，通过诱导活化CRB2/ERX1/2和PI13K/AKT信号通路，启动DNA复制，诱导内皮细胞增生；②VEGFR-3酪氨酸残基Y1063发生磷酸化，诱导活化CRKⅠ/Ⅱ和c-Jun氨基末端激酶Gnk1/2，引起细胞内信号级联反应的信号；③通过蛋白激酶C（PKC）依赖的p42/p44 MAPK活化途径和PI3K/AKT磷酸化产生的信号[12]。VEGFR-3通过与VEGF-C结合后，还调节血管渗透性，促进肿瘤组织进入淋巴管，抑制凋亡，导致肿瘤的高转移率的发生[13]。有研究报道HSP90抑制剂根赤壳菌素类可以抑制VEGF的表达[14]，17-AAG可以通过阻断STAT3通路抑制胃癌和乳腺癌细胞VEGF的表达[15]。本实验研究结果表明，VEGF-C在人肝癌HepG2细胞对照组中处于高表达，一定剂量的17-AAG可以明显下调VEGF-C蛋白的表达。提示VEGF-C蛋白参与了肝癌细胞增殖及转移的相关生物学行为的调控，17-AAG可以通过下调VEGF-C蛋白的表达抑制淋巴管的生成，可能是17-AAG抑制肝癌的机制之一。

总之，本次实验证实了HSP90抑制剂17-AAG能够抑制肝癌HepG2细胞的增殖，诱导凋亡，并通过下调VEGF蛋白阻碍肿瘤的侵袭。由于17-AAG发挥抗肿瘤的机制很多，还需进一步研究，为肝癌临床上的应用提供实验依据。

[参考文献]

[1] 李倩，杜佳，关鹏，等.中国2008年肝癌发病、死亡和患病情况的估计与预测[J].中华流行病学杂志，2012，33（6）：554-555.

[2] Jackson SE. Hsp90： structure and function [J]. Top Curr Chem，2013，328：155-240.

[3] ZOU B，SHI Q. Advances of HSP90 inhibitors treating acute myelogenous leukemia [J]. Basic & Clinical Medicine，2014，34：270-273.

[4] Hong DS，Banerji U，Tavana B，et al. Targeting the molecular chaperone heat shock protein90（HSP90）：lessons learned and future directions [J]. Cancer Treat Rev，2013， 39：375-387.

[5] Zhang F，Lazorchak AS，Liu D，et al. Inhibition of the mTORC2 and chaperone pathways to treat leukemia [J]. Blood，2012，119（25）：6080-6088.

[6] Wang SX， Ju HQ， Liu KS，et al. SNX-2112， a Novel Hsp90 Inhibitor， Induces G2/M Cell Cycle Arrest and Apoptosis in MCF-7 Cells [J]. Biosci Biotech Bioch，2011， 75（8）：1540-1545.

[7] Mimura N，Fulciniti M，Gorgun G，et al. Blockade of XBP1 splicing by inhibition of IRE1α is a promising therapeutic option in multiple myeloma [J]. Blood，2012，119（24）：5772-5781.

[8] O'Malley KJ，Langmann G，Ai J，et al. Hsp90 inhibitor 17-AAG inhibits progression of LuCaP35 xenograft prostate tumors to castration resistance [J]. The Prostate，2012，72（10）：1117-1123.

[9] Lu X，Xiao L，Wang L，et al. Hsp90 inhibitors and drug resistance in cancer： the potential benefits of combination therapies of Hsp90 inhibitors and other anti-cancer drugs [J]. Biochem pharmacol，2012，83（8）：995-1004.

[10] Hanson BE，Vesole DH. Retaspimycin hydrochloride （IPI-504）：a novel heat shock protein inhibitor as an anticancer agent [J]. Expert opinion on investigational drugs，2009，18（9）：1375-1383.

[11] Oshikawa G，Nagao T，Wu N，et al. c-Cbl and Cbl-b lig-ases mediate 17-allylaminodemethoxygeldanamycin-in-duced degradation of autophosphorylated Flt3 kinase with internal tandem duplication through the ubiquitin protea-some pathway [J]. J Biol Chem，2011，286：30263-30273.

[12] 沈飞琼.VEGF-C及其受体VEGFR-2/3与肺癌关系的研究进展[J].实用癌症杂志，2013，28（4）：452-455.

[13] Achen MG， Mann GB， Stacker SA. Targeting lymphangiogenesis to prevent tumour metastasis [J]. Br J Cancer，2006，94（10）：1355-1360.

[14] Hur E，Kim HH，Choi SM，et al. Reduction of hypoxia-induced transcription through the repression of hypoxia-inducible factor-1alpha/aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator DNA binding by the 90-kDa heat-shock protein inhibitor radicicol [J]. Molecular Pharmacology，2002，62（5）：975-982.

[15] 肖丽君，赵恩宏，赵爽，等.17-AAG对MCF-7细胞增殖的抑制作用及对STAT3和VEGF表达的影响[J].中国医科大学学报，2013，42（1）：65-68.

（收稿日期：2014-06-25 本文编辑：卫 轲）

[7] Mimura N，Fulciniti M，Gorgun G，et al. Blockade of XBP1 splicing by inhibition of IRE1α is a promising therapeutic option in multiple myeloma [J]. Blood，2012，119（24）：5772-5781.

[8] O'Malley KJ，Langmann G，Ai J，et al. Hsp90 inhibitor 17-AAG inhibits progression of LuCaP35 xenograft prostate tumors to castration resistance [J]. The Prostate，2012，72（10）：1117-1123.

[9] Lu X，Xiao L，Wang L，et al. Hsp90 inhibitors and drug resistance in cancer： the potential benefits of combination therapies of Hsp90 inhibitors and other anti-cancer drugs [J]. Biochem pharmacol，2012，83（8）：995-1004.

[10] Hanson BE，Vesole DH. Retaspimycin hydrochloride （IPI-504）：a novel heat shock protein inhibitor as an anticancer agent [J]. Expert opinion on investigational drugs，2009，18（9）：1375-1383.

[11] Oshikawa G，Nagao T，Wu N，et al. c-Cbl and Cbl-b lig-ases mediate 17-allylaminodemethoxygeldanamycin-in-duced degradation of autophosphorylated Flt3 kinase with internal tandem duplication through the ubiquitin protea-some pathway [J]. J Biol Chem，2011，286：30263-30273.

[12] 沈飞琼.VEGF-C及其受体VEGFR-2/3与肺癌关系的研究进展[J].实用癌症杂志，2013，28（4）：452-455.

[13] Achen MG， Mann GB， Stacker SA. Targeting lymphangiogenesis to prevent tumour metastasis [J]. Br J Cancer，2006，94（10）：1355-1360.

[14] Hur E，Kim HH，Choi SM，et al. Reduction of hypoxia-induced transcription through the repression of hypoxia-inducible factor-1alpha/aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator DNA binding by the 90-kDa heat-shock protein inhibitor radicicol [J]. Molecular Pharmacology，2002，62（5）：975-982.

[15] 肖丽君，赵恩宏，赵爽，等.17-AAG对MCF-7细胞增殖的抑制作用及对STAT3和VEGF表达的影响[J].中国医科大学学报，2013，42（1）：65-68.

（收稿日期：2014-06-25 本文编辑：卫 轲）

[7] Mimura N，Fulciniti M，Gorgun G，et al. Blockade of XBP1 splicing by inhibition of IRE1α is a promising therapeutic option in multiple myeloma [J]. Blood，2012，119（24）：5772-5781.

[8] O'Malley KJ，Langmann G，Ai J，et al. Hsp90 inhibitor 17-AAG inhibits progression of LuCaP35 xenograft prostate tumors to castration resistance [J]. The Prostate，2012，72（10）：1117-1123.

[9] Lu X，Xiao L，Wang L，et al. Hsp90 inhibitors and drug resistance in cancer： the potential benefits of combination therapies of Hsp90 inhibitors and other anti-cancer drugs [J]. Biochem pharmacol，2012，83（8）：995-1004.

[10] Hanson BE，Vesole DH. Retaspimycin hydrochloride （IPI-504）：a novel heat shock protein inhibitor as an anticancer agent [J]. Expert opinion on investigational drugs，2009，18（9）：1375-1383.

[11] Oshikawa G，Nagao T，Wu N，et al. c-Cbl and Cbl-b lig-ases mediate 17-allylaminodemethoxygeldanamycin-in-duced degradation of autophosphorylated Flt3 kinase with internal tandem duplication through the ubiquitin protea-some pathway [J]. J Biol Chem，2011，286：30263-30273.

[12] 沈飞琼.VEGF-C及其受体VEGFR-2/3与肺癌关系的研究进展[J].实用癌症杂志，2013，28（4）：452-455.

[13] Achen MG， Mann GB， Stacker SA. Targeting lymphangiogenesis to prevent tumour metastasis [J]. Br J Cancer，2006，94（10）：1355-1360.

[14] Hur E，Kim HH，Choi SM，et al. Reduction of hypoxia-induced transcription through the repression of hypoxia-inducible factor-1alpha/aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator DNA binding by the 90-kDa heat-shock protein inhibitor radicicol [J]. Molecular Pharmacology，2002，62（5）：975-982.

[15] 肖丽君，赵恩宏，赵爽，等.17-AAG对MCF-7细胞增殖的抑制作用及对STAT3和VEGF表达的影响[J].中国医科大学学报，2013，42（1）：65-68.

（收稿日期：2014-06-25 本文编辑：卫 轲）