枸杞多糖对2型糖尿病大鼠视网膜炎症因子表达的影响

魏燕华，成差群，徐建平

(广东省广州市荔湾区芳村中医医院，广东 广州 510361)

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病微血管病变的并发症之一，是目前世界范围内致盲的主要原因之一。传统医学称糖尿病视网膜病变为消渴目病，枸杞对消渴目病的治疗功用早有记载。《本草通玄》载:“枸杞子补肾益精，水旺则骨强，而消渴目昏，腰疼、膝痛无不愈矣”。枸杞既能降糖，又能补肝明目、补肾益精可列为首选之品。枸杞多糖(LBP)是从枸杞子中提取而得到的一种天然大分子水溶性多糖，是由醛糖或酮糖通过糖苷键连接在一起的多聚物，具有多种生物活性，药理作用广泛。王继红等[1]通过临床和动物试验证实了枸杞对糖尿病视网膜病变有治疗作用。炎症因子的聚集在视网膜病变的发生和发展中均起着重要作用，肿瘤坏死因子－α(TNF－α)等介导的炎性反应在DR的发生、发展及血管并发症的发病中起到了媒介作用。本研究中观察了枸杞多糖对血－视网膜屏障炎症因子TNF－α、白细胞介素－6(IL－6)及C反应蛋白(CRP)水平的影响，探索枸杞多糖对糖尿病视网膜病变保护作用的机理。

1 材料与方法

1．1 仪器、试剂与动物

酶标仪(美国BIO－RAD公司，型号为iMark);血糖仪及试纸(德国罗氏公司，型号为ACCU－CHEK Performa Nano)。链脲佐菌素(美国sigma公司，批号为S0130);LBP粉剂(宁夏启元药业公司，纯度为58．56%，批号为GF03002－l)，用生理盐水配制成质量浓度为60 g/L的溶液，4℃冰箱贮藏，使用前稀释至所需浓度;盐酸二甲双胍(中美上海施贵宝制药有限公司，批号为P20110923);大鼠TNF－α酶联免疫分析试剂盒(R＆D进口分装，批号为201205);大鼠IL－6酶联免疫分析试剂盒(R＆D进口分装，批号为201205);大鼠CRP酶联免疫分析试剂盒(R＆D进口分装，批号为 201205)。SD 大鼠，180～220 g，雌雄各半，SPF 级，广东省医学实验动物中心提供，许可证号为SCXK(粤)2009－0004。

1．2 试验动物模型制备及分组[3]

大鼠适应性饲养3 d，除空白对照组外，其余大鼠给予高糖高脂饲料(在标准全价混合饲料的基础上添加蔗糖、炼猪油和蛋黄，比例分别为10%蔗糖、10%猪油、5%蛋黄)，喂养5周后，腹腔注射STZ(新鲜配制，溶于0．1 mmol/L柠檬酸钠缓冲液中，pH为4．5)25 mg/kg，每日1次，连续2 d。空白对照组普通饲料喂养5周，再腹腔注射等量柠檬酸缓冲液，每日1次，连续2 d。注射药物2 d后间隔1 d，测大鼠空腹血糖(测试前禁食12 h)，以血糖含量16．7 mmol/L为大鼠2型糖尿病模型造模成功的判定标准。将2型糖尿病模型大鼠随机分为5组，各10只，即2型糖尿病模型组，枸杞多糖高、中、低剂量组[剂量分别为0．6，0．3，0．15 g/(kg·d)]，盐酸二甲双胍组[0．25 g/(kg·d)]。于模型复制成功的第2天起，各组大鼠按上述剂量灌胃给药，空白对照组给予等量生理盐水，连续给药2周。

1．3 样本取材与检测

药物治疗2周后，大鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，迅速摘取眼球，于手术显微镜下沿矢状切面剖开眼球，弃去眼内容物(房水、玻璃体及晶状体)，用无齿显微镊细心地取出视网膜组织，生理盐水漂洗2次，再用吸水纸吸干水分，用精密天平称重后，以pH为7．2的预冷磷酸盐缓冲液冰浴下制成10%组织匀浆。将组织匀浆液置4℃离心机中，以5 000 r/min的速率离心5 min，取上清。TNF－α，IL－6，CRP浓度均按试剂盒说明书测定。

1．4 统计学处理

2 结果

结果见表1。

表1 枸杞多糖对2型糖尿病模型大鼠视网膜TNF－α，IL－6，CRP浓度的影响(，n=10)

表1 枸杞多糖对2型糖尿病模型大鼠视网膜TNF－α，IL－6，CRP浓度的影响(，n=10)

注:与 2型糖尿病模型组比较，＊P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;与正常对照组比较，▲P ＜0．01。

组别正常对照组2型糖尿病模型组盐酸二甲双胍组LBP高剂量组LBP中剂量组LBP低剂量组剂量(g/kg)－ －0．25 0．6 0．3 0．15 TNF－α(ng/L)1．27 ± 0．51 2．80 ± 0．84▲1．81 ± 0．58＊1．36 ± 0．80＊＊2．18 ± 0．83 2．07 ± 0．95 IL－6(ng/L)3．76 ± 0．71 6．70 ± 1．55▲4．09 ± 1．01＊＊4．87 ± 1．47＊4．82 ± 1．33＊5．62 ± 1．45 CRP(mg/L)0．89 ±0．33 1．72 ±0．40▲0．98 ± 0．18＊＊1．15 ± 0．36＊＊1．12 ± 0．25＊＊1．33 ±0．41

3 讨论

枸杞是药食同源的植物，在秦汉时代的《神农本草经》中已有记载，其性甘平质润，有补益肝肾、明目之功效。LBP为其主要成分，对多种细胞有保护作用，可抗氧化、抑制细胞凋亡[4－6]。何剑锋等[7]的试验证明，枸杞对DR有治疗作用[7]。但LBP对DR炎症因子的作用机制的研究国内外少见报道。

DR是糖尿病微血管病变的并发症之一，是致盲的主要原因之一。长期慢性高糖血症是其发病基础，并受全身新陈代谢、内分泌及血液因素等影响。近代研究证实，自由基损伤、周细胞与视网膜血管内皮细胞的凋亡、炎症因子的聚集与黏附、血液流变学异常、脂代谢障碍在视网膜病变的发生、发展中均起着重要作用。2型糖尿病在临床治疗的过程中，很多患者会出现一定情况的炎症症状，其CRP，TNF－α，IL－6等往往存在异常升高的情况。常规治疗对患者的炎症因子改善并不理想，对血糖的控制情况较差[8]。亚临床炎症引起DR的可能机制为2型糖尿病患者非酶糖基化终产物(AGES)增多，与视网膜血管内皮细胞上的AGES受体或配体结合，使其炎症因子(如TNF－α，IL－6等)，刺激肝细胞产生CRP，并引起局部炎症，引起血管内皮细胞功能障碍或直接损伤内皮细胞而产生微血管病变。

CRP是急性时相反应蛋白之一，是炎性反应或组织损伤时的非特异性标志物。研究发现，糖尿病患者血清CRP明显增高，而非糖尿病者则正常，现普遍认为2型糖尿病可能是炎症因子介导的炎性反应性疾病，并可能导致了胰岛B细胞分泌胰岛素功能受损及产生胰岛素抵抗。在美国进行的大型前瞻性研究证实，CRP是2型糖尿病发病的预测因子，可能在胰岛素抵抗和2型糖尿病发病中扮演了重要角色[9]。

TNF－α可直接损伤血－视网膜屏障，提高视网膜血管通透性[10]。TNF－α是介导炎性反应的重要介质，它参与体内的多种病理过程，也是体内炎症和组织损伤的敏感指标。大量证据表明，TNF－α可能通过增加糖基化酶活性，使中性粒细胞与视网膜内皮细胞黏附性增强[11]。TNF－α可刺激巨噬细胞及其他细胞产生IL－8等，增强视网膜局部炎性反应，促进表皮生长因子(EGF)、血小板源性生长因子(PDGF)等的生成和释放并协同其增殖作用。这些促生长因子可刺激血管细胞增殖，最终导致眼内新生血管形成。另外，CRP，TNF－α水平增高引起胰岛素抵抗也可引起视网膜微血管内皮细胞的病理性增生，与亚临床炎症共同作用，引起 DR[12]。

IL－6与内分泌激素、神经递质及某些效应物质等组成重要的网络系统，广泛而精细地调节胰岛B细胞的分化、生长和分泌[13]。Carey等[14]对小鼠的研究发现，高血糖可促进胰岛细胞分泌IL－6，同时低剂量IL－6又可促进胰岛素分泌，高剂量则抑制胰岛素分泌。IL－6在糖尿病血管病变中也起重要作用，有报道显示，糖尿病并动脉粥样硬化患者普遍存在循环中IL－6水平增高。

本研究结果显示，2型糖尿病大鼠的视网膜CRP，TNF－α，IL－6水平均升高，表明其可能是DR发生、发展的危险因素。2型糖尿病大鼠视网膜的CRP升高与胰岛素抵抗、胰岛素敏感性降低及高血糖所致的高IL－6有关，CRP参与急性反应，引起血管内皮功能改变和形态变化影响细胞膜的完整性，使血管内皮的通透性改变，导致DR发生。而高浓度的IL－6可促进胰岛B细胞分化产生细胞毒作用，促使胰岛B细胞凋亡;IL－6以炎性介质的方式参与糖尿病大鼠DR的发生。另一方面，免疫系统激活产生的炎症因子TNF－α诱导胰岛素抵抗的发生，导致大鼠出现高血糖等变化，从而促进2型糖尿病的发生与发展。经过LBP治疗后，不同剂量组的LBP能不同程度地降低2型糖尿病大鼠视网膜CRP，TNF－α，IL－6的浓度水平，其药理作用呈一定量效关系，并以高、中剂量组效果最好。LBP具有可长期使用而无毒副作用的优点，故探讨其生物活性及作用机制具有深远意义。

综上所述，LBP具有下调 CRP，TNF－α，IL－6的表达，稳定视网膜屏障上的紧密连接，减少血－视网膜屏障的炎症因子释放的作用，从而抑制DR发生与发展。

[1]王继红，刘学政，那东波，等．枸杞多糖对糖尿病视网膜病变保护作用的研究进展[J]．辽宁中医药大学学报，2010，6(12):47－49．

[2]Mysliwiec M，Zorena K，Balcerska A，et al．The activity of NAcetyl－ beta－D－glucosaminidase and tumor necrosis factor－alpha at early stage of diabetic retinopathy development in type 1 diabetes mellitus children[J]．Clin Bio Chem，2006，39(8):851 －856．

[3]王春艳．链脲佐菌素诱导大鼠2型糖尿病模型的建立[J]．吉林医药学院学报，2010，31(1):22 －23．

[4]刘长建，姜 波，刘 亮，等．枸杞子多糖提取工艺优化及体外抗氧化活性研究[J]．时珍国医国药，2009，20(3):6 631．

[5]汪朝阳，黄秀榕．枸杞多糖对氧化损伤大鼠晶状体上皮细胞凋亡的调控[J]．眼视光学杂志，2003，5(2):89 －91．

[6]田丽梅．近年来中药枸杞的研究进展[J]．中国中药杂志，2006，31(19):1 603－1 607．

[7]何剑峰，周伟平，仇宜解，等．枸杞对糖尿病视网膜病变患者抗氧化反应作用的临床研究[J]．中国中医眼科杂志，1998，8(2):74－76．

[8]朱大龙．炎症与2型糖尿病[J]．中国糖尿病杂志，2006，14(1):73－74．

[9]Pradhan AD，Manson JE，Rifai N，et al．C －reactive protein，interleuk in 6，and risk of developing type 2 diabetes mellitus[J]．JAMA，2001，286(3):327．

[10]Krylova IN，Sablin EP，Moore J，et al．Structural analyses reveal phosphatidyl in ositols as ligands for the NR5 orphan receptors SF－1 and LRH － 1[J]．Cell，2005，120(3):343 － 355．

[11]Ben－Mahmud BM，Chan WH，Abdulahad RM，et al．Clinical validation of a link between TNF－alpha and the glycosylation enzyme core 2 Gc-NAc－T and the relationship of this link to diabetic retinopathy[J]．Diabet ologia，2006，49(9):2 185 － 2 191．

[12]赵志勇，周予兰，王 伟，等．肿瘤坏死因子对糖尿病视网膜病变的诊断价值[J]．中国误诊学杂志，2007，7(1):65．

[13]姜明一，杨文东．2型糖尿病患者血清白细胞介素－6和脂联素水平变化及其相关性[J]．检验医学与临床，2008，5(17):1 057－1 058．

[14]Carey AL，Lamont B，Andrkopoulos S ，et al．Interleukin － 6 gene expression is increased in insulin resistant ratskeletal muscle following insulin stimulation[J]．Biochem Biophys Res Commun，2003，302(4):837．