应用里氏木霉发酵制备纤维素酶固体曲的研究

张 宁，蒋剑春，杨 静，卫 民，赵 剑 ，童娅娟

(中国林业科学研究院林产化学工业研究所;生物质化学利用国家工程实验室;国家林业局林产化学工程重点开放性实验室;江苏省生物质能源与材料重点实验室，江苏 南京 210042)

纤维素酶是一种多组分的复合酶，现在己经确定纤维素酶含有3种主要组分，即内切葡萄糖苷酶(EC3.2.1.4 EG)、外切葡萄糖苷酶(EC3.2.1.91CBH)和纤维二糖酶(EC3.2.1.21 BG)。在纤维素水解过程中首先由内切葡萄糖苷酶在纤维素链内部水解，降低其聚合度，然后由外切葡萄糖苷酶作用于非还原性末端释放出纤维二糖;最后由纤维二糖酶将纤维二糖水解为葡萄糖［1］。有多种微生物能够产生纤维素酶，例如好氧丝状真菌，好氧放线菌，厌氧嗜热细菌和厌氧真菌等［2］。迄今为止，产纤维素酶能力最强的常用的微生物是里氏木霉［3-4］，其纤维素酶产量高，所产的纤维素酶是胞外酶，易与菌体分离纯化而得到所需的酶，里氏木霉及其代谢产物安全无毒，不会影响生产人员和环境。利用纤维素酶转化纤维素原料制糖，进而转化为燃料乙醇、燃气等能源物质已成为当今世界的研究热点［5-6］。

固态发酵是一种具有节水、节能、产率高、排放低等独特优势的清洁生产技术，采用固态发酵技术生产纤维素酶比液体深层发酵具有较多优势［7］:发酵环境更接近于自然状态下的木霉生长习性，产生的酶系更全，有利于降解天然纤维素;固态发酵消耗能源少，设备投资相对减少;酶产品收率高，后续提取过程较液态发酵好处理［8］。故纤维素酶的工业化生产一般采用固态发酵法。

本文作者应用实验室诱变筛选得到的纤维素酶高产突变株T.reesei150-1-1［9］发酵制备纤维素霉固体曲，研究固态发酵条件对产酶的影响并对其进行优化，从而为发酵制备纤维素酶固体曲提供技术依据。

1 实验

1.1 菌种

纤维素酶高产菌株里氏木霉T.reesei150-1-1，本实验室筛选获得［9］。

1.2 固体培养基

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。

1.3 固态发酵培养基

按不同质量比称取原料麸皮和秸秆粉共10 g，添加不同体积的营养溶液，其组成为:硫酸铵1%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.05%，并用柠檬酸缓冲液调节培养基至不同pH值，于121℃灭菌60 min，冷却备用。

1.4 固态发酵产酶条件的确定

将用固体培养基培养得到的种子接入固态发酵培养基中进行固态发酵，依次考察麸皮与秸秆粉的配比、料液比、发酵时间、温度和初始pH值对产酶的影响，并用其优化值逐个替代初始工艺中相应值，初步确定固态发酵条件。发酵结束后提取纤维素酶，并测定固体曲纤维素酶活力。每项试验做3个平行样，取平均值。然后通过3因素3水平正交试验确定最佳产酶条件。

1.5 分析方法

1.5.1 粗酶的提取 取培养适当的纤维素酶固体曲5.0 g，加pH值为4.8的醋酸-醋酸钠(HAC-NaAC)缓冲液45 mL，酶液浸提方法为:摇床上30℃浸提1 h，摇床转数为95 r/min。之后用中速定性滤纸及真空泵抽滤，滤液即为用于测定的酶液。

1.5.2 纤维素酶活力的测定 还原糖法测定固体曲酶活力［10］。固体曲酶活力单位(U)定义为每小时产生1 μmoL还原糖(以葡萄糖计)所需酶量，样品的酶活力用每克湿曲所含的酶活力单位数(U/g)表示。

2 结果与分析

2.1 纤维素酶固体曲发酵培养基组成的研究

2.1.1 麸皮与秸杆粉用量对产酶的影响 麸皮与秸秆粉用量对固体曲酶活力的影响实验结果见图1。结果表明固体曲纤维素酶活力随着麸皮用量的增加、秸秆粉用量的减少先增加后略有降低，在麸皮与秸秆粉的比例为4∶1时酶活力达到最大值，与文献［11］报道结果一致。这可能是由于麸皮中富含淀粉、纤维素、半纤维素、有机氮及生长因子，这些营养物质可促进菌丝的生长，其中纤维素和半纤维素对酶的合成具有诱导作用，而加入适量的秸秆粉增加了培养基中纤维素和半纤维素的含量，进一步诱导了纤维素酶的合成和分泌［12］。

2.1.2 培养基料液比对产酶的影响 不同料液比(质量比)对产酶影响的实验结果见图2，由图2可知，培养基中的水分对固态发酵产酶有较大影响。水分少，菌丝体前期长势良好，但后期生长所需水分和营养供应不足，纤维素酶活力下降;水分太多使得菌丝体前期陡长，形成孢子时间较长，同时透气性下降，氧供给不足，影响菌体生长，也导致纤维素酶活力下降。在本研究中适宜T.reesei150-1-1产酶的料液比为 1∶2.5。

图1 麸皮和秸杆粉用量对酶活力的影响Fig.1 Effect of ratio between wheat bran and straw powder on cellulase activities of solid koji

图2 培养基料液比对酶活力的影响Fig.2 Effect of ratio of materials to liquid on cellulase activities of solid koji

2.2 纤维素酶固体曲发酵条件的研究

2.2.1 发酵时间对产酶的影响 T.reesei150-1-1发酵产纤维素酶需要一定的时间，从图3可以看出，随着发酵时间的延长，纤维素酶活力先慢慢增加;发酵时间为120 h时，纤维素酶活力达到最大值;再继续延长发酵时间，纤维素酶活力显著降低。这可能是由于培养基中营养成分耗尽，菌体停止代谢活动，有效发酵也就停止了。因此要得到酶活力较高的纤维素酶，控制发酵时间是关键环节。T.reesei150-1-1适宜发酵时间为120 h。

2.2.2 发酵温度对产酶的影响 从图4可以看出，温度对固态发酵产纤维素酶也有影响。在温度低于31℃的条件下，随着温度升高纤维素酶活力有所增大，31℃时纤维素酶活力达到最大，在高于31℃的条件下，纤维素酶活力则逐渐下降。微生物最适生长温度可能是由温度对生物体内无数个酶反应的综合作用决定的，微生物在最适生长温度以上生长速率降低，酶活力下降，可能是一些限速酶或其它酶的变性导致的。因此，对T.reesei150-1-1来说，适宜产酶的温度为31℃。

图3 发酵时间对酶活力的影响Fig.3 Effect of fermentation time on cellulase activities of solid koji

2.2.3 培养基初始pH值对产酶的影响 环境pH值可引起细胞膜电荷的变化，从而影响微生物对营养物质的吸收，影响代谢过程中酶的活性，改变营养物质的可给性和有害物质的毒性;而微生物代谢活动会改变环境pH值，所以培养基中往往要加缓冲剂。固体曲培养基用柠檬酸缓冲液调节初始pH值至4.2～6.6，考察初始pH值为 4.2、4.6、5.0、5.4、5.8、6.2 和 6.6 对固体曲酶活力的影响，实验结果见图5，发酵培养基初始pH值在4.2～5.0之间的条件下，随着pH值的升高固体曲纤维素酶活力显著增加;在pH值为5.0～6.6的条件下，随着pH值升高，纤维素酶活则呈下降趋势。在初始pH值为5.0时，T.reesei150-1-1产酶能力最强。

图4 发酵温度对酶活力的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on cellulase activities of solid koji

图5 培养基起始pH值对酶活力的影响Fig.5 Effect of pH value on cellulase activities of solid koji

2.3 正交试验优化固态发酵产酶条件 采用L9(33)正交表，考察发酵温度(A)、发酵时间(B)和初始pH值(C)对固体曲纤维素酶活力的影响，试验结果见表1。由表1可知，发酵时间对纤维素酶活力的影响最大，其次是发酵温度，影响最小的是初始pH值，即3因子对纤维素酶活力的影响顺序为发酵时间＞发酵温度＞初始pH值，酶活力最高的发酵条件组合是A2B3C3，即:发酵温度为31℃，发酵时间为120 h，初始pH值为5.5。经3次验证，在该反应条件下发酵得到的纤维素酶滤纸酶活为423.6 U/g。

表1 正交试验设计及试验结果分析Table 1 Design of orthogonal experiment list and the result analysis of test

3 结论

应用本实验室筛选得到的纤维素酶高产菌株T.reesei150-1-1发酵制备纤维素酶固体曲，通过正交试验优化固态发酵培养基组成及发酵条件，制备得到纤维素酶活力较高的固体曲及粗酶液。

3.1 应用里氏木霉150-1-1制备纤维素酶固体曲的固态发酵培养基中麸皮与秸杆粉的最佳质量比为4∶1，最佳料液比为 1∶2.5。

3.2 应用里氏木霉150-1-1制备纤维素酶固体曲的最优发酵条件为发酵温度31℃，发酵时间120 h，发酵起始pH值5.5，在此条件下发酵得到的纤维素酶固体曲酶活力达到423.6 U/g。

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