hDll1ext-Fc融合蛋白的表达纯化与初步鉴定

潘芸，高丽华，邵勇，王友亮，高招刚，段海峰，胡显文



hDll1ext-Fc融合蛋白的表达纯化与初步鉴定

潘芸，高丽华，邵勇，王友亮，高招刚，段海峰，胡显文

230601 合肥，安徽大学生命科学院（潘芸、高招刚）；100071 北京，军事医学科学院生物工程研究所（高丽华、邵勇、王友亮、胡显文），放射与医学研究所（段海峰）

获得高效表达 hDll1ext-Fc 融合蛋白的细胞系以及具有生物学活性的目的蛋白。

根据已知序列设计引物，并将 hDll1ext基因片段经 PCR 扩增，酶切后连接至 pIRES2-EGFP-Fc 中，挑选阳性克隆测序，将正确的重组质粒转染至 CHO-S 细胞，筛选高表达细胞系，利用 rProtein A 亲和柱纯化目的蛋白，并通过检测 Notch 下游信号分子 Hes1 的表达及双荧光素酶报告基因实验检测蛋白活性。

构建了 pIRES2-EGFP-hDll1ext-Fc 真核表达载体，并筛选了高效表达 hDll1ext-Fc 的 CHO-S 细胞系，纯化得到较高纯度的融合蛋白，配合生物活性检测实验显示，可溶性的 hDll1ext-Fc 能够激活 Hes1 报告基因，并且能上调 Notch 下游分子 Hes1 的表达，证明其能够激活 Notch 信号通路。

在 CHO-S 细胞中成功表达了 hDll1ext-Fc 融合蛋白，为进一步研究 Delta-like-1 的生物学功能奠定重要基础。

配体，Notch； CHO 细胞； Delta-like； Fc融合蛋白

基因首先在果蝇体内发现，由于该基因的缺失会导致果蝇翅膀边缘出现缺口（notch）而得名。Notch 信号传导通路广泛存在于脊椎与非脊椎动物体内，它是决定细胞命运的重要路径之一[1]。Notch 受体是由胞外区（extracellular Notch，ECN）和跨膜区/胞内区（Notch transmembrane，NTM）两个亚基组成的异二聚体，两者是通过共价键结合在一起的，并具有 Ca2+依赖性。果蝇中有2 种 Notch 配体，Delta 和 Serrate。线虫中 Notch 配体有 Lag2。哺乳动物中有多重 Notch 配体，与 Delta 高度相似的配体称为 Delta 或 Delta 样（Delta-like，Dll），与 Serrate 相似的称为 Serrate 或 Jagged。目前发现人的 Notch 配体共有 5 种，即 Delta-like-1、Delta-like-3、Delta-like-4、Jagged1、Jagged2。作为人重要 Notch 配体之一的 Delta 样配体 1 是由 723 个氨基酸组成的单次跨膜蛋白，其中胞外区含有 539 个氨基酸，由 1 个 N 端保守的 DSL（Delta/Serrate/Lag2）基序和 8 个表皮生长因子样重复序列（epidermal growth factor-like repeats，EGF-R）结构域组成，具有重要的生物学活性[2]。该 DSL 结构域结合 Notch 受体，促进受体异二聚体分离，进而受体活化激活下游信号，Notch 受体经过三次剪切，最终胞内区释放到细胞核，激活发状分裂相关增强子（hairy and enhancer of split，Hes）等靶基因的转录，进而调节细胞分化和组织发生[3]。

近几年研究表明，Notch 信号传导通路与肿瘤发生有关，如 Purrow 等[3]发现 Notch 配体 hDll1 在多种神经胶质细胞瘤中过度表达，并且在联合其他细胞因子的情况下，hDll1 胞外区可以抑制造血干细胞的分化并促进其增殖[4]。鲁茁壮等[5]克隆表达了 hDll1 的胞外区，并经过集落培养检测证实其对原始的造血祖细胞具有扩增作用。因此，本实验通过构建胞外区全基因与人 IgG1 Fc 融合的真核表达质粒，并在 CHO-S 细胞中表达纯化得到较高纯度且具有生物活性的 hDll1ext-Fc（human Delta-like-1 extracellular domain-Fc）融合蛋白，为后续的功能研究奠定重要基础。

1 材料与方法

1.1 材料

pIRES2-EGFP-Fc 质粒由本实验室构建保存；人 Delta-like-1 胞外区全基因由金斯瑞公司合成，以 pUC57-hDll1ext质粒的形式提供；CHO-S 细胞株为本实验室保存；Pyrobest DNA 聚合酶、Taq DNA聚合酶、dNTP 购自日本 Takara 公司；T4 DNA 连接酶以及限制性内切酶I、dIII、H I 购自美国 NEB 公司；质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒、DNA 上样缓冲液、DNA marker 均购自天根公司；蛋白标准分子量购自加拿大Fermentas 公司；转染试剂 Lipofectamine2000 购于美国 Life Technologies 公司；DMEM/F12 培养基、胎牛血清以及 CD CHO 培养基购自美国Gibco 公司；rProtein A 填料购自美国GE 公司；酶标抗体购自北京中杉金桥公司；BCA 蛋白定量试剂盒购自美国Thermo 公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega 公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 方法

1.2.1 pIRES2-EGFP-hDll1ext-Fc 和 pGL3-basic-1(promoter) 质粒的构建

1.2.1.1 pIRES2-EGFP-hDll1ext-Fc 质粒的构建 根据已知 hDll1ext基因序列设计引物 DllF 和 DllR，以合成的 pUC57-hDll1ext质粒为模板，PCR 扩增得到特异性目的片段，经I 和H I 双酶切克隆至 pIRES2-EGFP-Fc 载体中，转化 Top10 感受态大肠杆菌，挑取阳性克隆双酶切验证并送测序。

1.2.1.2 pGL3-basic-1(promoter) 质粒的构建 以动物细胞全基因组提取试剂盒提取 HeLa 细胞的全基因组，以 HesF1 和 HesR1 为上下游从基因组中扩增出含有目的片段的序列，并最终以 HesF2 和 HesR2 PCR 扩增目的片段，经I 和dIII 双酶切克隆至 pGL3-basic 载体中，转化 Top10 感受态大肠杆菌，挑取阳性克隆送至测序。

以上所需引物见表 1。

表 1 引物序列信息

1.2.2 高表达细胞系的筛选 根据 Lipofectamine 2000 转染试剂说明书将 pIRES2-EGFP-hDll1ext-Fc 质粒转染 CHO-S 细胞，以 750 μg/ml 浓度 G418筛选阳性克隆 2 周，计细胞数目，稀释细胞至终浓度为 8 个/ml，96 孔板单克隆，2 周后挑选单克隆，将所挑选细胞系换无血清，第 2 天收集无血清上清，200 倍稀释后，ELISA 法检测细胞株的表达水平，并且挑选保留其中表达量最高细胞系进行 Western blot 验证，一抗为 1000 倍稀释的兔抗人 Delta1 抗体，二抗为 5000 倍稀释的 HRP 标记的山羊抗兔 IgG。

1.2.3 hDll1ext-Fc 融合蛋白的纯化 摇瓶扩大培养筛选细胞系，收集培养上清，并将收集的 hDll1ext-Fc 上清离心浓缩去除杂蛋白，以 5 ml/min 的流速经过 3 倍柱体积结合液（50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，pH 7.3）处理的 rProtein A 亲和柱，待上样完毕后，平衡液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.3）洗杂蛋白至基线后，用洗脱液（0.1 mol/L Gly-HCl，0.9% NaCl，0.5% 吐温-80，pH 3.0）洗脱蛋白，饱和精氨酸调节 pH 至中性，保存于4 ℃。以 50 mmol/L NaOH 处理亲和柱，去除残留蛋白，并用 5 倍柱体积去离子水清洗柱子，最终以 20% 乙醇保存柱子，以防长菌。BCA 试剂盒测定纯化蛋白的浓度。

1.2.4 hDll1ext-Fc 的考马斯亮蓝 G250 快速染色 SDS-PAGE 使用 10% 的分离胶和 5% 的浓缩胶，将收集的蛋白过滤除菌，取 30 μl 样品与 4 × 上样缓冲液混匀后，沸水浴中变性 5 min，上样，80 V 电压待胶行至浓缩胶时改用 130 V 电压，直至跑到终点。取胶，与 500 ml ddH2O 微波炉中煮沸 3 ~ 5 min，倒去 ddH2O，加入考马斯亮蓝 G250 染色液，煮沸 3 ~ 5 min。回收染液，加入 500 ml ddH2O，煮沸 3 ~ 5 min，摇床脱色 5 min。倒去 ddH2O，看胶是否已脱色完毕，如果没有，可以重复以上步骤进行第 2 次脱色。

1.2.5 Western blot 检测 Notch 下游靶基因1 的表达 以 5 × 105个/ml 密度将 HeLa 细胞接种于 6 孔板，次日分别加入终浓度为 8 μg/ml 重组 hDll1ext-Fc 或对照 Fc，24 h 后以 RIPA（pH 7.4 50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.1% SDS，终浓度为 1 mmol/L PMSF）裂解细胞，SDS-PAGE 分离裂解物，360 mA 恒定电流 1 h 电转移至 PVDF 膜上，5% 脱脂奶粉封闭 1 h，用 1:500 稀释的兔抗 Hes1 单克隆抗体，1:1000 鼠抗 β-actin 抗体 4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜 3 次，用 1:5000 稀释的 HRP 标记的山羊抗兔 IgG 抗体以及山羊抗鼠 IgG 抗体 37 ℃孵育1 h，TBST洗膜 3 次，发光，显色。

1.2.6 双荧光素酶报告基因检测 hDll1ext-Fc 融合蛋白活性 以 2 × 105个/ml 密度接种 HeLa 细胞于 24 孔板，第 2 天用 Lipofectamine2000 脂质体转染 200 ng 报告基因质粒 pGL3-basic-1 (promoter) 和 10 ng 内参质粒 pRL，6 h 后换 RPMI 1640 完全培养基，分别加入终浓度为 1、2、4、8 μg/ml 重组蛋白 hDll1ext-Fc，转染 48 h 后，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。

1.3 统计学处理

以双荧光素酶（firefly）活性与内参海肾腔肠素酶（renilla）活性的比值，显示荧光素酶的相对活性。Excel 和 SPSS 15.0 软件处理，采用单因素方差分析，以< 0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 pIRES2-EGFP-hDll1ext-Fc 质粒的构建

以合成的 pUC57-Dll1ext为模板 PCR 扩增，经琼脂糖电泳分析，在 1500 bp 左右得一特异条带，与预期大小一致（图 1），并以I 和H I 双酶切克隆至pIRES2-EGFP-Fc，挑选阳性克隆送测序，结果正确。

bp M 1 4500300020001200800500

Figure 1 PCR amplification of hDll1ext(M: DNA marker III; 1: hDll1ext)

2.2 pIRES2-EGFP-hDll1ext-Fc 质粒的转染及单克隆筛选

参照 Lipofectamine2000 说明书将 pIRES2- EGFP-hDll1ext-Fc 质粒转染 CHO-S 细胞，24 h 后荧光显微镜检测可见荧光（图 2A），转染效率在30% ~ 40% 之间，750 μg/ml 浓度 G418 加压筛选，10 d 左右形成成簇细胞群，此时消化细胞，细胞计数仪测定细胞浓度为 2.3 × 105个/ml，将细胞稀释 3 × 104倍，使得每 200 μl 培养基中含有 1 ~ 2 个细胞，96 孔板单克隆，每孔加入 200 μl 培养基，共单克隆 10 个 96 孔板，10 d 后显微镜观察可见成团的单克隆（图 2B），挑选由 1 个细胞扩增得到的细胞团，共筛选得到 40 株单克隆细胞株。

图 2 转染细胞绿色荧光图（A：转染 24 h 后荧光下的 CHO-S 细胞；B：96 孔板中形成成簇的单克隆细胞；40 ×）

Figure 2 The fluorescence of transfected cells (A: Transfected CHO-S cell after 24 hours; B: The monoclonal cell in 96-well plate; 40 ×)

2.3 hDll1ext-Fc 培养上清的 ELISA 检测及 Western blot 验证

将筛选的 40 株细胞株换成 200 μl 无血清培养基，第 2 天，ELISA 检测表达量，波长 405 nm 处测定值，如表 2 所示有 3 株细胞值在 1.0 以上，分别为 2E4、10C7、10H3，冻存上述 3 株细胞株于液氮中保存。取 10C7 培养上清进行 Western blot 验证，同时以瞬时转染空载体 pIRES2-EGFP-Fc 的细胞上清为阴性对照，结果发现，筛选细胞株 10C7 培养上清在 70 kD 左右出现单一的阳性结果，且符合理论分子量大小，阴性则无（图 3），表明所筛选的细胞株能够正确表达目的蛋白。

2.4 目的蛋白 rProtein A 亲和柱纯化

将细胞培养上清过滤除菌，以 5 ml/min 的速率通过 rProtein A 亲和柱，目的蛋白即牢牢结合于柱子，以 pH 3.0 Gly-HCl 洗脱，得到单一的洗脱峰（图 4），洗脱体积为 30 ml左右，最高 UV 值达到 2000 mAu。在线清理系统（Clean- in-Place，CIP）得到 150 mAu 的洗脱峰（图中未显示），该峰出现的主要原因是有些目的蛋白结合于 rProtein A 亲和柱过牢，pH 3.0 Gly-HCl 不足以将其洗脱，只有在强碱（50 mmol/L NaOH）的作用下才能洗脱下来。

表 2 单克隆细胞株无血清上清检测

A B

图 3 细胞株 10C7 蛋白免疫印迹分析结果（A：筛选细胞株 10C7 无血清上清；B：瞬时转染空载体 pIRES2-EGFP- Fc 后无血清上清）

Figure 3 Analysis result of Western blot (A: Serum free medium of the cell line 10C7; B: Serum free medium in the condition of transient transfection the empty vector pIRES2- EGFP-Fc)

2.5 洗脱蛋白的考马斯亮蓝快速染色

经 BCA 试剂盒测定纯化所得 hDll1ext-Fc 蛋白浓度为 1.5 mg/ml，取 30 μl 样品进行 SDS- PAGE，经考马斯亮蓝 G250 快速染色后在 70 kD 左右得单一条带（图 5），与预期结果一致，并且如图所示所得蛋白纯度高于 95%。

2.6 hDll1ext-Fc 上调 Notch 下游靶基因Hes1 的表达

Western blot 检测发现，与对照组 Fc 比较，在细胞数量基本一致的情况下，hDll1ext-Fc 的加入明显增强了1 基因的表达（图 6）。说明可溶性状态下的 hDll1ext-Fc 融合蛋白的刺激能够上调 HeLa 细胞 Notch 下游信号分子1 基因的表达，该蛋白在可溶性条件下即能发挥生物学功能。

图 4 pH3.0 Gly-HCl 洗脱目的蛋白纯化洗脱峰

Figure 4 The eluting peak of purified protein by pH 3.0 Gly-HCl

bp M 1 170130957255433426

Figure 5 The SDS-PAGE of hDll1ext-Fc protein (M: Standard protein marker; 1: Purified interest protein)

图 6 hDll1ext -Fc 上调 Hes1 的表达

Figure 6 hDll1ext-Fc fusion protein up-regulated the expression of Hes1

2.7 双荧光素报告基因检测可溶性 hDll1ext-Fc 融合蛋白的活性

2.7.1 pGL3-basic-1(promoter) 质粒的构建 以人的基因组为模板 PCR 扩增得到包含1 基因启动子的 2300 bp 左右的基因序列，结果与预期一致（图 7A）。经I和d III 双酶切克隆至载体 pGL3-basic，挑选阳性克隆送测序结果正确。

kb M 1 321A

Figure 7 Result of Dual-Luciferase Reporter Assay [A: PCR result of Hes1 promoter; M: 1kb DNA ladder; 1:1 promoter; B: Co-transfect 10 ng internal reference pRL and 200 ng pGL3-basic-1(promoter) in HeLa, Dual-Luciferase Reporter Assay in different concentration of recombination protein (1, 2, 4, 8 μg/ml) acts on the HeLa cells transfected after 48 hours, data are representative of three independent experiments (*< 0.05;**< 0.01;***< 0.001 vs control)]

2.7.2 双荧光素酶检测融合蛋白的生物学活性 将上述构建质粒以及内参质粒 pRL 同时转染 HeLa 细胞，不同浓度 hDll1ext-Fc 融合蛋白处理细胞，48 h 后，双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测结果显示，对应 1、2、4、8 μg/ml 蛋白浓度，firefly 活性与renilla 活性比值分别为 0.194、0.340、0.463、0.893。可以看出，同对照组 0.187 相比，重组的 hDll1ext-Fc 融合蛋白能够激活 Notch 信号通路，并且随着浓度的增加，Notch 信号通路激活的程度也不断增强（图 7B）。

3 讨论

有限的脐带血干细胞不足以满足提供给成人的干细胞移植，并且异体移植存在严重的排斥反应，甚至引起患者死亡。近年来干细胞的体外增殖研究成为医学界的热门领域之一[6]。Notch 信号传导通路目前被认为是解决干细胞扩增的最有前途的研究方向之一，hDll1 作为人 Notch 通路重要的配体，成为各国科学家研究的重要方向。近期研究发现 Notch信号通路的激活能够引起小鼠造血祖细胞（HSPC）的扩增[7]，并且在 NOD-SCID 免疫缺陷小鼠模型中，通过 Dll1ext扩增的脐带血干细胞具有显著的快速多向分化功能[8]。

鉴于以上，本实验构建了 hDll1 胞外功能区与免疫球蛋白 IgG1 Fc 片段的真核表达质粒，载体带有 EGFP 的荧光标记，易于后续单克隆的筛选，由于带有 IgG1 的 Fc 片段有利于 hDll1ext-Fc 的纯化，直接采用 rProtein A 亲和柱即可得到高纯度的目的蛋白，并且大大延长了其在生物体内的半衰期。通过 Western blot 检测发现，与对照组相比，可溶性的 hDll1ext-Fc 能够显著上调 Notch 下游1 基因的表达，同时我们将 Notch 信号通路靶基因1 的启动子整合至 pGL3-basic 载体中，下游是荧光素酶基因，当 Notch 信号通路激活后，下游靶基因1 的启动子激活，荧光素酶基因就会表达，两者共同证明重组得到的可溶性 hDll1ext-Fc 能够激活 Notch 信号通路，具有生物学活性。

之前部分学者认为 Notch 配体在固定化的状态下才能激活 Notch 通路[9]，但是本实验表明可溶性的 hDll1ext-Fc 同样能发挥生物学功效，特别在 8 μg/ml 浓度作用更为明显，两者存在分歧的主要原因可能是作用浓度的不同，前者的作用浓度一般在 ng/ml 水平，确切的机制有待于进一步研究。

总之，本次实验选用 CHO-S 细胞进行的 hDll1ext-Fc 蛋白的表达，为进一步的蛋白功能评价及其在干细胞增殖等方面的研究提供了基础保障。

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Expression, purification and preliminary identification of hDll1ext-Fc fusion protein

PAN Yun, GAO Li-hua, SHAO Yong, WANG You-liang, GAO Zhao-gang, DUAN Hai-feng, HU Xian-wen

To obtain the CHO-S cell lines expressing hDll1ext-Fc (human Delta-like-1 extracellular domain-Fc) fusion protein and the target protein with biological activity.

The hDll1extgene was amplified through PCR with the primers designed according to the known sequences, then inserted into pIRES2-EGFP-Fc vector, transformed into the competent cells. The positive clones were screened for sequencing. The recombinant plasmid pIRES2-EGFP-hDll1ext-Fc was transfected into the CHO-S cells, and then the high expressed cell lines were screened and the interest protein was purified with affinity rProtein A column. The biological activity of hDll1ext-Fc was determined by Dual-Luciferase Reporter Assay and the express of Hes1 which is a downstream factor in Notch pathway.

We obtained the eukaryotic expression vector pIRES2-EGFP-hDll1ext-Fc, high expressed cell lines and high purified hDll1ext-Fc fusion protein. The experiment of biological activity showed that soluble hDll1ext-Fc activated Hes1 reporter gene and up-regulated the expression of Hes1.

The recombinant plasmid pIRES2-EGFP-hDll1ext-Fc is constructed and the fusion protein is expressed, which lays the important foundation of further study on its biological function.

Ligand, Notch; CHO cells; Delta-like; Fc fusion protein

HU Xian-wen,Email: huxw1969@163.com

“重大新药创制”国家科技重大专项(2011ZX09102-001-30、2012ZX09102301-001)

胡显文，Email：huxw1969@163.com

2013-12-06

Author Affiliations: School of Life Science, Anhui University, Hefei 230601, China (PAN Yun, GAO Zhao-gang); Institute of Biotechnology (GAO Li-hua, SHAO Yong, WANG You-liang, HU Xian-wen), Institute of Radiation Medicine (DUAN Hai-feng), Academy of Military Medical Science, Beijing 100071, China