具有血管内皮细胞生长因子受体-2酪氨酸激酶抑制作用的链霉菌次生代谢产物2754R的研究

蒋忠科，张洋，郭连宏，姜蓉，孙承航



具有血管内皮细胞生长因子受体-2酪氨酸激酶抑制作用的链霉菌次生代谢产物2754R的研究

蒋忠科，张洋，郭连宏，姜蓉，孙承航

100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所

分离鉴定链霉菌 I06A-02754 发酵液中具血管内皮生长因子受体-2 酪氨酸激酶（VEGFR2-CD）抑制活性的强极性次生代谢产物。

采用大孔吸附树脂、阴离子交换树脂、MPLC、HPLC 等分离手段对次生代谢产物进行分离纯化；通过 UV、IR、 HR-ESI 质谱、1D-NMR 和2D-NMR 对其结构进行鉴定，以ELISA 法检测其次生代谢产物对 VEGFR2-CD 的抑制活性；以 MTT 法检测化合物对肿瘤细胞的抑制活性。

从发酵液的水溶性部分分离得到一个极性较大的胡桃霉素类次生代谢产物——2754R；其化学结构与胡桃霉素 D 一致，对 VEGFR2-CD 表现出一定的抑制活性；MTT 实验显示化合物 2754R 对 HepG2 细胞、MCF-7 细胞和 BEL-7402 细胞没有明显的抑制活性（IC50> 10 μmol/L）。

化合物 2754R 是具有 VEGFR2-CD 活性的胡桃霉素类次生代谢产物。

血管内皮生长因子受体 2； 链霉菌属； 胡桃霉素 D

肿瘤血管的形成依赖于血管生长因子，如果阻断这种生长因子，则可以抑制肿瘤的生长[1-2]。血管内皮生长因子（VEGF）是同肿瘤血管形成、生长、转移及调节肿瘤脉管的通透性等方面密切相关的关键生长因子，同其受体（VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3）相结合发挥作用[3-5]。由于VEGF 的活性主要由 VEGFR2 来介导[5-7]，因此，以VEGFR2 为靶点开发抗肿瘤药物是重点研究方向。以 VEGFR2 为靶点的抗肿瘤药物已有一些上市，如 Sorafenib、Sunitinib、Pazopanib 等[8]。VEGFR2-CD 是 VEGFR2 的胞内区，具有受体酪氨酸激酶活性。Zhao 等[9]和 Solowiej 等[10]研究表明，VEGFR2-CD 抑制剂对 VEGFR2 同样具有抑制活性，并认为其作为酪氨酸激酶抑制剂筛选模型是可行的。通过以 VEGFR2-CD 为靶点的酶抑制剂筛选，获得了一株阳性链霉菌株——I06A-02754，并从其发酵液水溶性部分分离得到具有 VEGFR2-CD抑制活性的强极性化合物 2754R。本文报道了化合物 2754R 的分离纯化和结构确认及其对 VEGFR2-CD 的抑制活性和对肿瘤细胞的细胞毒作用。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 菌株 链霉菌 I06A-02754 来自本所菌种筛选中心，由本所生物工程室保存。

1.1.2 培养基

⑴种子和发酵培养基：麦芽浸膏 5 g、葡萄糖5 g、蛋白胨5 g、牛肉浸膏 5 g、玉米浆 4 g、黄豆饼 10 g、淀粉 20 g、碳酸钙 4 g、蒸馏水 1 L，pH = 7.1。

⑵斜面 ISP2（YM）培养基：酵母粉 4 g、麦芽浸膏粉 10 g、葡萄糖 4 g、琼脂 12 g、蒸馏水1 L，pH = 7.1。

1.1.3 试剂 三氟乙酸（TFA）、乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯化钠均为北京化工厂生产，分析纯；HPLC 级乙腈为美国 SK Chemicals 公司产品；重组 KDR-CD、吐温-20、Poly(E4Y)、Na3VO4为美国 Sigma 公司产品；小鼠磷酸化的酪氨酸抗体（PY99）为美国 Santa Cruz Biotechnology 公司产品；辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠 IgG（H + L）抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；辣根过氧化酶显色底物 TMB/H2O2由中国医学科学院基础医学研究所提供；MTT 购自北京中山生物技术有限公司。

1.1.4 缓冲液 PBS 缓冲液：KH2PO40.024%、Na2HPO40.363%、KCl 0.02%、NaCl 0.8%，pH = 7.4；PBST 缓冲液：0.1% 吐温-20 的 PBS 缓冲液。

1.1.5 分离填料 XAD-5 型大孔吸附树脂和201 × 4 强碱性阴离子交换树脂购自天津南开大学化工厂；ODS-C18 柱色谱介质为日本 Shimadzu 公司产品；Sephadex LH-20 为瑞典 Pharmacia 公司产品，上海化学试剂厂分装，装入 1.5 cm × 100 cm玻璃柱；HP-20 大孔吸附树脂为日本三菱化学公司产品；中压液相色谱柱 ULTRA PACK ODS30/50（15 mm × 300 mm）、高效液相色谱半制备柱Zorbax SB-C18（9.4 mm × 250 mm，5 μm）和高效液相色谱分析柱 Zorbax SB-C18（9.4 mm × 150 mm，5 μm）均为美国安捷伦公司产品。

1.1.6 仪器 1200 型高压液相色谱仪为美国安捷伦公司产品；Buchi-011 型旋转蒸发仪为瑞士步琪公司产品；Anke TDL-40B 型低速离心机购自北京科瑞公司；Modulyo 型真空冷冻干燥机为英国爱德华公司产品；FMI-C 型中压液相色谱仪为日本 Yamazen 公司产品；680 型酶标比色仪为美国 Bio-Rad 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 菌株的发酵 将斜面培养基上生长良好的菌株 I06A-02754 接种至含 50 ml 种子培养基的 250 ml 三角烧瓶中，在 28 ℃和 250 r/min 条件下振荡培养 48 h，再按 5% 的接种量转接于含 100 ml 发酵培养基的 500 ml 三角瓶中，于 28 ℃、250 r/min 条件下振荡培养 96 h，收获发酵液。

1.2.2 2754R 的分离纯化及条件优化 I06A-02754菌株发酵液原分离条件为布氏漏斗滤去菌丝后，先后通过 XAD-5 型大孔树脂及201 × 4 强碱性阴离子交换树脂，然后用 HP-20 树脂脱盐。脱盐后的粗品浓缩上样于Sephadex LH-20 柱，50% 甲醇洗脱，最后将所得红色半纯品用中压色谱纯化，15% 乙腈（0.05% TFA）洗脱，得化合物 2754R。但该分离提取步骤较为烦琐，根据化合物 2754R 含有羧基，在酸性溶液中稳定性好的结构特点，我们对分离条件进行了优化，将 XAD-5 大孔树脂流出样品的 pH 值调为 4.0，然后再用乙酸乙酯萃取，旋蒸后得桔黄色活性粗品A，粗品A 上样于SephadexLH-20 柱，60% 甲醇洗脱，收集橙色活性带，浓缩得半纯品，最后用反相半制备 HPLC 纯化，制备条件如下：流动相为 15% 乙腈水溶液（0.05% TFA），流速为 1 ml/min，检测波长 254 nm，收集保留时间为 11.6 min 的峰，离心浓缩除去乙腈和水，得化合物 2754R，纯度大于 95%。

1.2.3 活性检测方法

1.2.3.1 ELISA 法检测化合物VEGFR2-CD 抑制活性 采用 10 倍稀释法，获得化合物2754R 浓度为 10、1、0.1、0.01、0.001 mg/ml 的样品，根据文献[11]的方法检测化合物VEGFR2-CD 抑制活性。本实验中设立样品空白对照，抑制率（%）= [1 –（450样品/450空白对照）]× 100%。

1.2.3.2 MTT 法测定化合物对肿瘤细胞的抑制活性[12]将对数生长期细胞用胰酶消化后配制成浓度为 1 × 104个/ml 的细胞悬液，接种于 96 孔板，每孔 100 μl，培养 24 h；每孔加入含不同浓度化合物（10、1、0.1、0.01、0.001 μmol/L）及相应溶剂对照的新鲜培养基 100 μl（DMSO 终浓度 < 0.1%）；每组设 3 个平行孔，于 37 ℃继续培养 72 h 之后加以无血清培养基新鲜配制的 0.5 mg/ml MTT 100 μl，继续培养 4 h；最后每孔加入 150 μl DMSO 溶解甲瓒颗粒，用微型振荡器振荡混匀后，酶标仪测定值（参考波长 450 nm，检测波长 570 nm）。以溶剂处理肿瘤细胞为对照组，按下述公式计算化合物对肿瘤细胞的抑制率：

抑制率（%）=（对照组平均值–化合物组平均值）/对照组平均值× 100%。

2 结果

2.1 2754R 的理化性质与结构鉴定

化合物 2754R 为橙色无定型粉末，易溶于甲醇、乙腈和二甲基亚砜，不溶于环己烷，微溶于水；溶于碱性水溶液，且在碱性溶液中共轭体系变长，呈红色。2754R 在甲醇溶液中的紫外光谱（UV）在 227、283 和 409 nm 处有最大吸收。IR 在 2400 ~ 3500 cm-1有一宽峰，3187、3081、1695、1631、1610、1579、1290、1205 和 724 cm-1处有较强吸收。比旋光度为 +78.2°（浓度为 0.435 mg/ml，甲醇）。1H-NMR（CD3OD，600 Mz）δ：2.37（1H，dd，J = 8.4，15.6，3'-H），2.44（1H，dd，J = 4.2，15.6，3'-H），2.71（1H，dd，J = 6.6，12.6，1'-H），4.28（1H，m，2'-H），2.81（1H，dd，J = 7.2，12.6，1'-H），7.15（1H，d，J = 8.4，6-H），7.54（1H，d，J = 8.4，8-H），7.60（1H，t，J = 8.4，7-H）；13C-NMR（CD3OD，150 Mz）δ：32.14（C-1'），42.93（C-3'）， 68.44（C-2'），114.95（C-4a），119.88（C-8），122.49（C-2），123.94（C-6），134.07（C-8a），138.11（C-7），162.31（C-5），175.52（C-4'），175.77（C-3），185.87（C-1），186.59（C-4）。

图 1 2754R 的平面结构（A）及HMBC（ ）和1H-1H COSY（ ）相关图（B）

化合物2754R 的 ESI-MS（+）显示其准分子离子峰为 293（M + H）+、315（M + Na）+、331（M + K）+；因此可以确定该化合物的分子量为 292。HR-ESI-MS：[M-H]-实测值为 291.04741，计算值为 291.05048，结合1H-NMR、13C-NMR 综合分析，确定该化合物的分子式为 C14H10O7。通过对1H-NMR、13C-NMR、HSQC 和 DEPT 谱的综合分析可知分子中有 8 个季碳（δC：186.59，185.87，175.51，162.31，157.77，134.07，122.48，114.94），4 个次甲基碳（δC：138.11，123.93，119.88，68.44）和 2 个亚甲基碳（δC：42.92，32.14），共 14 个碳原子，其中 3 个为羰基碳信号（δC：186.59，185.87，175.51），8 个为烯碳信号（δC：162.31，157.77，138.11，134.07，123.93，122.48，19.88，114.94）。在1H-1H COSY 谱中，δ：7.60（1H，t，J = 8.4 Hz，7-H）和 δ：7.54（1H，d，J = 7.2 Hz，6-H）、δ：7.15（1H，d，J = 8.4 Hz，8-H）相关；在 HMBC 中，8-H、6-H 和 C-4a，7-H 和 C-5、C-8a 相关。因此，结合 HSQC、1H-1H COSY 和 HMBC，化学位移为 134.07（C-8a）、114.95（C-4a）和 162.31（C-5）的 3 个季碳和化学位移为 123.94（C-6）、138.11（C-7）和 119.88（C-8）的 3 个叔碳组成一个 1,2,3 三取代的芳环。此外，在1H-1H COSY 中，9-H、11-H 和 δ：4.28（1H，m，10-H）的相关峰能被观察到，结合在 HMBC 中的 9-H 和 C-11（δ：42.93），11-H 和 C-9（δ：32.14）、C-12（δ：175.52）的相关峰，可以确定分子中含有一个 2'-羟基丁酸侧链；HMBC 中，1-H 和 C-1（δ：185.87）、C-3（δ：157.77）、C-2（δ：122.49），8-H 和C-1（δ：185.87）在1H-NMR（DMSO-6）中共有3 个化学位移为 11，一个化学位移为 4.9 的活泼氢，以及 C-3 的化学位移为157.77，C-5 的化学位移为 162.31，表明 C-3 和 C-5 为连氧的烯碳。此外，IR 数据也印证了芳香环、羰基及活泼氢的存在。综合以上信息可以推断出该化合物的结构如图 1 所示。

经查阅文献[13]，2754R 的1H-NMR、13C-NMR 数据与胡桃霉素 D 几乎完全一致，因此，确定 2754R 为已知的化合物胡桃霉素 D。

2.2 2754R 的 VEGFR2-CD 抑制活性

应用ELISA 法检测其对 VEGFR2-CD 的抑制活性，结果分别为 20.2%、14.7%、6.1%，当浓度低至0.01 mg/ml 时则未表现出对 VEGFR2-CD 的抑制活性。由以上结果可知：2754R 对VEGFR2-CD 有弱的抑制活性，其抑制活性呈浓度依赖性。

2.3 2754R 的细胞毒活性

MTT 实验显示，2754R 对人肝癌 HepG2 细胞、人乳腺癌 MCF-7 细胞和人肝癌BEL-7402 细胞在所测的浓度范围（0.001 ~ 10 μmol/L）均未表现出抑制活性。表明 2754R 对以上肿瘤细胞没有明显的抑制作用。

3 讨论

抗生素一般产量低，成分复杂，分离提取困难，尤其是水溶性组分更难分离，但对一些酸性或碱性化合物，通过pH 的改变，可以改变其极性，便能用简单、常规的萃取方法实现快速提取。化合物 2754R 含有游离的羧基及羟基，极性偏大，在 pH为 7.5 的发酵液中处于水溶性状态，大大增加了分离纯化的难度。后续分离纯化研究中，我们将流出液的 pH 调为 4.0 左右，这样化合物 2754R 在溶液中的解离度大大降低，脂溶性增强，可用乙酸乙酯进行萃取，浓缩后用甲醇溶解，再上样于 Sephadex LH-20 柱，并进一步用反相半制备 HPLC纯化，大大提高了分离的效率。

化合物 2754R 为具有VEGFR2-CD 抑制活性的胡桃霉素类化合物，这类化合物的母核结构为胡桃醌，胡桃醌属萘醌类化合物，因存在于胡桃科核桃属植物胡桃楸和核桃的树皮、根皮、青果皮及叶中而得名。胡桃醌具有明确的抗肿瘤作用，对 S180 实体瘤、小鼠腹水型肝癌、自发性胃癌及小鼠移植型乳腺癌等均具有明显的抗癌活性[14-15]。有研究表明，胡桃醌在体外细胞水平及器官水平对内皮血管形成具有明显的抑制作用[16-17]。来源于微生物的胡桃霉素类化合物最早由日本学者报道[18]，随后德国哥廷根大学的 Laatsch 研究组陆续报道了一系列的胡桃霉素类化合物，包括其二聚体。该类化合物具有抗革兰阳性菌、革兰阴性菌及真菌的活性，也有一定的细胞毒性[13,19-21]。化合物 2754R 在酶的水平上表现出一定的对VEGFR2-CD的抑制活性，但 MTT 实验显示该化合物对所测的肿瘤细胞没有明显的抑制活性，原因可能是其极性较大，较难穿透细胞膜。本文首次报道了胡桃霉素 D 的VEGFR2-CD 抑制活性，拓展了酪氨酸激酶抑制剂的范围，为合成新的酪氨酸激酶抑制剂，进而发现靶向抗血管生成药物开拓了新的思路。

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Study of the secondary metabolite 2754R produced byas inhibitor of VEGFR2-CD

JIANG Zhong-ke, ZHANG Yang, GUO Lian-hong, JIANG Rong, SUN Cheng-hang

To discover antagonists of VEGFR2-CD from the fermentation broth produced bystrainI06A-02754.

Under guidance of ELISA assay against VEGFR2-CD, compound 2754R was isolated and purified by combination of different column chromatographies and HPLC. The structure of compound 2754R was identified by combination of analysis of UV, IR, HR-ESI-MS and1D-NMR,2D-NMR. The cytotoxicity of compound 2754R was tested by MTT assay.

Compound 2754R was purified and structurally identified as Juglomycin group antibiotics, and was the same with Juglomycin D. Compound 2754R showed weak antagonistic activity against VEGFR2-CD by ELISA assay, but did not show obvious cytotoxicity on HepG2 (), BEL-7402 (human hcarcinoma) and MCF-7 (human breast cancer) cell lines at 10 μmol/L.

It is firstly reported compound 2754R (Juglomycin D) has antagonistic activity against VEGFR2-CD.

Vascular endothelial growth factor receptor-2;; Juglomycin D

JIANG Rong, Email: jr5602@yahoo.com; SUN Cheng-hang, Email: chenghangsun@hotmail.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.03.004

国家自然科学基金（81172963）；“重大新药创制”国家科技重大专项（2012ZX09301-002-001-018）；北京市自然科学基金（7133249）；中国医学科学院医药生物技术研究所中央级公益性科研院所基本科研业务专项（IMBF201204）

姜蓉，Email：jr5602@yahoo.com；孙承航，Email：chenghangsun@hotmail.com

2013-11-15

Author Affiliation: Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China