CRP、qPCR、组织病理学冰冻和石蜡切片评价在诊断假体关节感染中的应用

张延辉，刘琳琳，郝琳娜



CRP、qPCR、组织病理学冰冻和石蜡切片评价在诊断假体关节感染中的应用

张延辉，刘琳琳，郝琳娜

157011 黑龙江省牡丹江医学院红旗医院骨外科（张延辉），超声科（刘琳琳），眼科（郝琳娜）

假体周围关节感染（periprosthetic joint infection，PJI）是髋关节和膝关节手术最严重的并发症，一旦发生，常常给患者造成灾难性后果，而且长期抗感染及多次手术将极大地增加患者经济负担并影响关节功能[1]。PJI在诊断方面仍然非常困难[2]，常规细菌培养在很长一段时间被视为诊断 PJI 的“金标准”。然而，最近的研究表明，这种方法的准确性有限，尤其在低度感染时，常引起假阴性结果[3]。所以迫切需要一个更准确的诊断方法。唐浩和周一新[4]报道，如果符合以下标准，可以认为 PJI 明确存在：①存在与假体相通的窦道；②受累人工关节的 2 处假体周围组织或关节液标本中分离出同一病原体；③满足以下 6 条中的 4 条：红细胞沉降率（ESR）或 C 反应蛋白（CRP）水平升高、滑膜白细胞计数升高、滑膜中性粒细胞（PMN）百分比升高、受累关节出现化脓表现、假体周围组织或关节液标本中 1 次培养分离出细菌、400 倍放大率下，假体周围组织的病理学分析在每高倍显微视野下发现大于 5 个 PMN。

对于 PJI 的诊断，我们采用血清 CRP检测作为术前诊断工具，病理组织学冰冻切片评价和实时定量聚合酶链反应（qPCR）为术中诊断工具，组织病理学评估和细菌培养为术后诊断工具。Esteban 等[5]曾报道，术中qPCR 诊断 PJI 被认为是能够特异性识别甲氧西林耐药菌的快速方法。组织病理学评价由于其特异性高常作为细菌性感染的可靠诊断，但 Kanner 等[6]的报道表明，冰冻切片分析灵敏性低。在本研究中，比较了每一个诊断试验的特性，包括术前血清 CRP、qPCR、组织病理学冰冻和石蜡切片的敏感性和特异性，以及在诊断临床 PJI 病例中的应用，以文献[4]报道标准为最终的诊断参考。

1 对象和方法

1.1 研究对象

86 例手术患者均来自 2008 年 1 月 – 2013 年 6 月牡丹江医学院红旗医院，其中 63 例髋关节手术患者，23 例膝关节手术患者。86 例手术患者中有 10 例因怀疑有感染或无菌性松动行清创手术，15 例进行 1 周抗生素治疗。所有病例，手术之前检测血清 CRP，术中收集组织样品标本（髋关节或膝关节 3 个不同的部位）用于qPCR、组织病理学检查（冰冻和石蜡组织切片）以及细菌培养。考虑到对试验的可能影响，排除 5 例炎症性疾病病例，包括 2 例类风湿关节炎，2 例恶性肿瘤，1 例系统性红斑狼疮。因此，本研究对其余 81 例患者PJI 情况进行分析。

1.2 主要仪器和试剂

VC 750 超声破碎仪购自美国 Sonics 公司；DNA纯化柱购自爱西默（中国）股份有限公司；LightCycler 96 实时荧光定量 PCR 仪购自瑞士 Roche 公司；BX53光学显微镜购自日本 Olympus 公司；徕卡 2165 旋转式切片机购自德国 Nussloch 公司；CRP 的 ELISA 试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；DNA 提取试剂盒购自德国 Qiagen 公司；标准肉汤培养基购自上海研生生化试剂有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 血清 CRP 检测 所有患者抽取外周静脉血，采用 ELISA 法测定 CRP，设置截断值 1.0 mg/dl 作为 PJI 诊断的节点。

1.3.2 qPCR 参照文献[7-8]的方法。按照 DNA 提取试剂盒说明进行 DNA 提取，将从手术室采取的髋关节或膝关节3 个不同部位的样品置于 1 ml 无菌水中，使用 40 kHz频率超声粉碎 5 min。然后使用 DNA 纯化柱对超声处理的溶液进行纯化。qPCR 方法检测细菌中 16s rRNA 基因及定量分析，使用qPCR方法特异性检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性 mecA 基因。临床样本和阴性对照之间阈值的差值（ΔCT）主要基于 LightCycler 定量模式计算。如果 ΔCT 值超过 1.9 或者至少在 1 个样品检测到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，即可认为该病例被感染。

1.3.3 组织病理学观察 术中冰冻切片和术后石蜡组织切片的组织病理学分析由本院病理科进行。每高倍显微视野（400 ×）超过 5 个 PMN 可诊断为 PJI。

1.3.4 细菌培养 使用标准肉汤培养基对所有的标本进行细菌培养，如果 2 个或 2 个以上不同的组织或关节液样品中培养出同样的细菌，将培养物记为阳性。

1.4 统计学处理

实验数据以例数（n）表示，统计软件为 SPSS 17.0，计量资料采用检验，< 0.05 为差异具有统计学意义。采用 ROC 曲线取截断值的数据分析方法，确定 CRP 的截断值，并计算术前血清 CRP 值、qPCR、冰冻和石蜡切片组织病理学的敏感性、特异性、阴性似然比、阳性似然比[9]。

2 结果

2.1 术前血清 CRP、qPCR、冰冻和石蜡切片组织病理学及细菌培养结果

术前血清 CRP 结果中，61 例小于 1.0 mg/dl，20 例大于 1.0 mg/dl，平均 CRP 值为 1.7 mg/dl。qPCR 结果中，33 例呈阴性，48 例呈阳性。病理组织冰冻切片结果中，59 例呈阴性，22 例呈阳性。病理组织石蜡切片结果中，63 例呈阴性，18 例呈阳性。微生物培养结果中，71 例呈阴性，10 例呈阳性。10 例微生物培养阳性患者的qPCR、组织病理学、术前血清 CRP 的相应结果见表 1。手术前接受抗生素治疗的 15 例患者，3 例细菌培养呈阳性结果，并且呈高血清 CRP 值（大于 9.0 mg/dl）。12 例细菌培养呈阴性结果，但是qPCR 检测出其中 9 例呈阳性。

表 1 10 例细菌培养阳性样品的 qPCR、组织病理学和术前血清 CRP 的结果

2.2 术前血清 CRP、qPCR、冰冻和石蜡切片组织病理学灵敏性、特异性考察

术前血清 CRP 诊断的灵敏性为 90%，特异性为 85%；qPCR诊断的灵敏性为 90%，特异性为 45%；病理组织冰冻切片诊断的灵敏性为 71%，特异性为 89%；病理组织石蜡切片诊断的灵敏性为 90%，特异性为 87%，结果见表 2。

2.3 术前血清 CRP、qPCR、冰冻和石蜡切片组织病理学阳性似然比、阴性似然比

术前血清 CRP 阳性结果似然比为 5.8，阴性结果似然比为 0.12；qPCR阳性结果似然比为 1.6，阴性结果似然比为 0.18；病理组织冰冻切片阳性结果似然比为 6.6，阴性结果似然比为 0.32；病理组织石蜡切片阳性结果似然比为 7.1，阴性结果似然比为 0.11，结果见表 3。

2.4 典型病例

表 1 中病例 2 的患者术前血清 CRP 值为 0.42 mg/dl，怀疑有 PJI。术中冰冻切片病理组织学结果为阴性，但实时qPCR 检测结果显示阳性，因此确诊感染并取出假体。此外，石蜡切片组织病理学呈阳性，细菌培养发现耐甲氧西林表皮葡萄球菌。

表 2 术前血清 CRP、qPCR、组织病理学冰冻和石蜡切片的灵敏性、特异性、阳性预测值和阴性预测值

表 3 术前血清 CRP、qPCR、冰冻和石蜡切片组织病理学阳性似然比、阴性似然比、诊断优势比和 95% 置信区间

表 1 中的病例 8 是典型 PJI患者，其术前血清 CRP 值为 1.5 mg/dl，术中石蜡切片组织病理学结果发现有大量的滑膜中性粒细胞，故取出假体。正如预期的那样，qPCR 检测结果也呈阳性。术后石蜡切片病理结果与术中发现一致，细菌培养发现链球菌。

3 讨论

不同的诊断试验方法具有不同的敏感性和特异性。故此，几种不同试验方法的结合应用是准确诊断 PJI 必不可少的。临床指南建议红细胞沉降率、术前血清 CRP 检测、术中组织病理学冰冻切片用于 PJI 评价[10]。本研究比较了术前血清 CRP、qPCR、组织病理学冰冻和石蜡切片与细菌培养结果在诊断 PJI 中的应用。

术前血清 CRP 检测对 PJI 的诊断具有重要意义，该检测有足够的灵敏性和特异性，最近的临床指南推荐其截断值为 1.0 mg /dl。大多数医院可以进行该项检测，因此，推荐术前血清 CRP 为 PJI 诊断的最佳方式。当其与 ESR 结合应用，结果更加准确[10]。ESR > 30 mm/h 以及 CRP >1.0 mg/dl 被认为感染水平升高[4]。基于术前血清 CRP 或 ESR 的结果怀疑有 PJI 时，要进行其他实验室检查，比如关节穿刺抽液。qPCR检测病毒或细菌感染已经应用到很多领域。Kobayashi 等[11]报道，通过qPCR鉴定细菌的 DNA 对诊断 PJI 有应用价值，其灵敏性为 87%，特异性为 80%。而且qPCR还可用于 PJI 的定量评价。可以肯定，术前血清 CRP 值、qPCR、细菌培养与组织病理学的结果呈正相关。

一般情况下，术中怀疑 PJI 的患者应采用冰冻切片分析。有研究表明，冰冻切片中 PMN 对于诊断 PJI具有较高的实用性，PMN 越多，PJI 的几率越大[12]。然而另有研究表明，冰冻切片分析的灵敏性低[6]。因此，应该寻找包括qPCR 在内的更高灵敏性的测试方法。

本研究证实，术前血清 CRP 灵敏性与qPCR相当，其高特异性接近于组织病理学评价，支持临床指南建议使用术前血清 CRP 为 PJI的术前筛查[10]。至于 PJI 的诊断，本研究发现，qPCR以其灵敏性高，良好的阴性似然比，对感染的筛查有应用价值，而组织病理学评价以其优良的特异性和良好的阳性似然比，适用于感染的明确诊断。qPCR的灵敏性与组织病理学的特异性成为术中诊断 PJI的合理组合。

偶尔出现的问题是qPCR检测呈阳性病例而组织病理学显示阴性，反之亦然。这种矛盾的结果可能由诸如术前抗生素治疗或低致病细菌感染等因素所致。在这种情况下，每一个诊断试验的特性应予以考虑。例如病例 2 的患者，不能简单地依据血清 CRP 值和组织病理学结果诊断为感染，还应参考qPCR的结果。另一方面，术前评价高度怀疑感染的患者，例如病例 8 的患者，组织病理学阳性结果对于明确诊断很重要。

组织病理学研究目前允许比较冰冻和石蜡切片。通常，冰冻和石蜡切片结果之间的差异可能由于切片质量差异引起。有研究表明，冰冻切片分析与石蜡切片分析结果一致，而另一份研究显示，两者的一致率较低。Stroh 等[13]报道了较高的一致率为 97%，其中，平均每高倍视野大于 5 个多形核白细胞是标准的阳性诊断。Tohtz 等[14]报道了相对较低的一致率为 78%。尽管冰冻切片分析比石蜡切片分析灵敏性低，但是，本研究证实了它具有高特异性的特点。故此，冰冻切片分析更适合于 PJI的明确诊断。

本研究的局限性是可能忽略细菌培养阴性的病例。细菌培养呈阴性，但组织病理学或qPCR呈阳性的病例也是存在的。本研究中，有 4 例术前血清 CRP、qPCR和组织病理学检查均呈阳性，但细菌培养呈阴性结果的病例，这可能是低度感染所致。另外抗生素的应用对结果的影响应予以考虑。抗生素治疗可能影响细菌培养、qPCR和组织病理学结果。另外，必须考虑潜在的炎症对实验结果的影响，如类风湿关节炎。故此，本研究排除了 5 例这样的患者。

综上所述，本研究证明以下 3 点：首先，术前血清 CRP 以其灵敏性高被肯定为有价值的术前筛查 PJI 试验；第二，qPCR 和组织病理学冰冻切片评价在诊断 PJI 中扮演重要角色，同时使用几种方法诊断 PJI 时考虑其不同的特点做出正确判断是非常重要的；第三，组织病理学冰冻切片尽管灵敏性较低，但特异性高，结果等同于石蜡切片。

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张延辉，Email：yanhuizhang@126.com

2014-02-07

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.03.013