PES1蛋白与雄激素受体的相互作用及定位

关鑫，王洪远，任伟，杜佩云，秘晓林，程龙，叶棋浓

1.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850；2.大连医科大学 肿瘤干细胞研究院，辽宁 大连 116000；3.安徽医科大学 附属安庆市立医院口腔科，安徽 安庆 246600；4.福建农林大学 生命科学学院，福建 福州 350002

雄激素受体（androgen receptor，AR）属于核受体超家族，是一种配体依赖的转录因子[1]，包含4个结构域，即N端的调控结构域（NTD）、DNA结合结构域（DBD）、铰链区（H）及配体结合结构域（LBD）[2]。NTD结构域又称为转录激活域，它包含一个重要的激活区域 AF1（activation function 1），当人工删减LBD区域后，AF1可通过配体不依赖的方式发挥作用。LBD结构域包含一个配体依赖的激活区域AF2，其突变或缺失会明显降低AR的转录活性[3]。当AR与雄激素结合后，会发生构象变化而与热激蛋白HSP90分离。此时AR将以二聚体的形式入核，并与基因中的特定序列——雄激素应答元件（andro⁃gen response element，ARE）结合，进而激活靶基因的转录[4]。

AR在大多数组织中均有不同程度的表达。无论在正常发育中还是病理状态下，AR都发挥重要的作用。目前，AR已成为前列腺癌的治疗靶标[5]。此外，有研究表明AR在很多乳腺癌患者中高表达，且可能成为治疗ER-/HER2+乳腺癌患者的新靶标[6-9]。

人PES1蛋白由588个氨基酸残基（aa）组成，除包含多个核定位信号和一个小泛素化样修饰蛋白（small ubiquitin-like modifier，SUMO）位点外，在311～415 aa区域存在典型的 BRCT 结构域[10-12]。PES1主要定位于核中，具有DNA结合能力。低等真核生物、鼠或人PES1在正常胚胎发育、核糖体生物发生、DNA复制、染色体稳定性和细胞周期调控中起重要作用[13-16]。

PES1在许多肿瘤，如乳腺癌、胶质瘤、前列腺癌及胃癌等中表达水平上调。我们发现，在雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性的乳腺癌中，PES1通过调节ERα和ERβ的平衡来影响乳腺癌的发生和发展[17]。也有研究表明，在ER阴性的乳腺癌细胞中，PES1仍能促进细胞生长，发挥癌基因的作用，提示在乳腺癌中，PES1还有不依赖于ER的作用方式[18]，但这种作用方式尚不明确。AR和ER有着相似的结构，AR能够调节ERα阳性和ERα阴性乳腺癌细胞的生长，因此我们检测了PES1是否能够与AR相互作用，调节AR的表达水平。我们在实验中发现，PES1能够与AR相互作用，PES1不调节AR的表达水平，这为研究PES1对乳腺癌中AR功能的调节提供了重要线索。

1 材料与方法

1.1 材料

人胚肾293T细胞由本实验室保存；乳腺癌ZR75-1敲低PES1稳定克隆细胞系由本实验室构建；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自Invitrogen公司；DMEM培养基和胎牛血清购自GIBCO公司；转染试剂LipofectAMINE 2000购自Invitrogen公司；质粒Flag-PES1、Flag-PES1（1-110）、Flag-PES1（111-220）、Flag-PES1（221-322）、Flag-PES1（311-588）、Flag-PES1（415-588）均由本实验室构建；质粒MYC-AR、MYC-AR（1-568）、MYC-AR（484-651）、MYC-AR（484-918）由周建光研究员实验室赠送；Flag-HRP、MYC-HRP抗体购自Sigma公司；兔抗人GAPDH抗体和辣根过氧化物酶偶联的IgG均购自Santa Cruz公司。

1.2 细胞培养及转染

293T细胞和ZR75-1细胞用含10%胎牛血清、50 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM培养基，在CO2含量为5%的37℃孵箱中培养，细胞长满时用胰酶消化传代。质粒转染时严格按照说明书中转染试剂与质粒的量进行操作，转染4～6 h后更换新鲜的培养基，转染24 h后收细胞。

1.3 Western印迹及免疫共沉淀

1.3.1 Western印迹 收细胞后加入SDS加样缓冲液，煮沸15 min，离心后取上清液进行SDS-PAGE，电转移至硝酸纤维素膜，用5%脱脂奶粉于4℃封闭过夜，加入用5%脱脂奶粉1∶5000稀释的MYC抗体或1∶10 000稀释的GAPDH抗体，室温轻摇1 h，用TBST洗膜3次，每次7 min，加入用5%脱脂奶粉稀释的辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG，室温轻摇1 h，用TBST洗膜3次，每次7 min，用化学发光法显色5 min，压片显影。

1.3.2 免疫共沉淀 收集细胞后加入裂解液于冰上裂解30 min，用注射器反复吹打至染色质断裂，离心去上清，加入偶联抗体的琼脂糖珠，4℃结合4 h至过夜，用裂解液洗涤沉淀物3次，每次10 min，在洗涤后的琼脂糖珠中加入SDS上样缓冲液进行Western印迹分析，用另一种抗体检测2种蛋白质之间是否存在相互作用。

2 结果

2.1 PES1蛋白与AR的相互作用

将带有FLAG标签的PES1表达质粒和带有MYC标签的AR表达质粒共转染293T细胞，24 h后收细胞，用抗FLAG琼脂糖珠进行免疫共沉淀，用FLAG和MYC抗体进行Western印迹检测。结果表明，带有MYC标签的AR只在含有FLAG PES1的免疫共沉淀产物中被检测出来（图1），即AR能够特异地与PES1蛋白结合。

2.2 PES1与AR的相互作用定位

图1 免疫共沉淀检测PES1与AR的相互作用

图2 带FLAG标签的PES1截短突变体示意图

为了确定PES1与AR相互作用的区域，首先构建了带有FLAG标签的PES1不同区域的表达载体（图2），将这些载体和MYC-AR质粒共转染293T细胞，用上述方法进行免疫共沉淀之后用Western印迹检测。结果表明，PES11-110、PES1111-220、PES1221-322、和PES1311-588均能与AR相互结合，而PES1415-588不能结合（图3）。此外，将FLAG-PES1质粒与带MYC标签的AR不同区域的表达质粒共转染293T细胞进行免疫共沉淀后发现，PES1与AR484-918能够结合，而与AR1-568、AR484-651不结合（图 4），说明 PES1结合在AR651-918区域。

2.3 PES1不调节AR水平

我们以前的研究发现PES1能和ER结合，并调节ER的蛋白表达水平。因此，我们检测了PES1是否能够调节AR的蛋白表达水平。在ZR75-1细胞中转染PES1 siRNA，48 h后收集细胞，用Western印迹检测PES1和AR的表达水平，发现敲低PES1后AR的蛋白水平没有发生变化（图5）。

3 讨论

在本研究中，我们发现PES1能够与AR相互作用，PES1的多个区域能与AR结合，且主要结合在AR的AF2结构域，PES1不能调节AR的表达水平。

PES1的截短突变体中，除PES1415-588外的区域均能与AR结合，提示PES11-110、PES1111-220、PES1221-322和PES1311-588内均含有与AR直接或间接结合的区域。PES1能够与AR的AF2区域结合，而AF2区域是配体依赖的转录激活域，提示PES1可能作为AR的共调节因子来调节AR的转录活性和功能，这需要进一步通过实验验证。我们以前的研究发现PES1能与ERα、ERβ相互作用，通过抑制泛素化连接酶CHIP与ERα的结合升高ERα的表达水平，通过促进CHIP与ERβ的结合下调ERβ的表达水平。CHIP也是AR的泛素化连接酶，能够介导AR通过泛素-蛋白酶体途径降解。因此，我们检测了PES1是否能够调节AR的表达水平，证实PES1不能调节AR的蛋白表达水平，提示PES1可能不能调节CHIP介导的AR蛋白降解。

图3 免疫共沉淀检测PES1突变体与AR的相互作用

图4 免疫共沉淀检测PES1与AR突变体的相互作用

图5 Western印迹检测ZR75-1细胞中PES1对AR的影响

乳腺癌发生发展的分子机制复杂，众多调节因子参与了这一过程。有研究表明，AR在ERα阳性细胞中通过抑制ERα的活性而抑制细胞生长，在ERα阴性细胞中则促进细胞生长。目前关于AR在乳腺癌中的功能及其调节因子和机制的研究较少，本实验发现了一个新的AR相互作用蛋白PES1，PES1可能通过调节AR的活性调节乳腺癌细胞的增殖。

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