肠出血性大肠杆菌毒力因子Z1444的原核表达及其丝/苏氨酸激酶活性验证

李崭，李涛，陈芳红，刘雄，周育森，王慧

1.广西医科大学，广西 南宁 5300002；2.军事医学科学院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071

肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic Esche⁃richia coli，EHEC）O157∶H7作为一种重要的食源性致病菌，其感染特点为世界流行性、高发病率与病死率，以及抗生素治疗会加剧病情等[1]。自美国1982年首次暴发流行以来，许多国家相继发生了EHEC O157∶H7的感染流行[2]。现今其感染已成为一个全球性的公共卫生问题，受到各国广泛关注[3]。对该菌致病机制的研究，已成为世界医学界的关注点[4-6]。

EHEC O157∶H7的致病机制与其基因组中某些特殊区域有关，这些区域可编码与EHEC致病性有关的毒力因子，而毒力岛就是这些特殊基因的编码区[7]。O157∶H7毒力岛包括编码eae基因的LEE岛、前噬菌体上编码志贺样毒素（Shiga-like toxin，SLT）的slt基因和大质粒（pO157）编码的hly、katP、espP、toxB、stcE基因等[8]，目前对EHEC致病机制的研究主要集中在毒力岛编码系统上[9]。通过对毒力岛的研究发现了一些重要的毒力因子，但迄今所发现的毒力因子不足以解释0157∶H7的全部致病过程[10]。

我们通过对EHEC毒力岛编码序列的扫描，在毒力岛前噬菌体编码区志贺样毒素基因slt上游位置发现了功能未知的Z1444蛋白基因[11-13]。通过毒力因子基因同源比对，分析致病基因保守区域，预测EHEC染色体一段完整基因ORF Z1444具有潜在的致病性，该基因编码的蛋白很可能参与细菌与宿主的相互作用，并且可能是具有Ⅲ型分泌系统的致病菌重要的效应蛋白（毒力因子）。因此，研究0157∶H7 Z1444蛋白，对于进—步了解细菌与宿主的相互作用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

EHEC O157∶H7 EDL933株和 pET-28a（+）载体为本室保存；大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）感受态细胞，pEASY-T1载体，Taq酶，dNTP及DNA marker购自TransGen公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京博迈德公司；NdeⅠ、XhoⅠ限制性内切酶及T4DNA连接酶购自NEB公司；His抗体和磷酸丝氨酸/苏氨酸抗体分别购自CST与Ab⁃cam公司。

1.2 Z1444基因的扩增

根据 GenBank中的 Z1444基因序列（ID：959087）设计引物 Z1444（up）（5'-CATATGCTAACT CCATACAAAAG-3'）和 Z1444（down）（5'-CTCGAG GTTATCCTTTAATAACCTATACTG-3'），分别在上下游引物中引入NdeⅠ、XhoⅠ酶切位点（下划线序列）。以EHEC O157∶H7全菌裂解液为模板，Z1444（up）、Z1444（down）为引物扩增目的基因。PCR条件：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，53℃复性30 s，72℃延伸90 s，30个循环；72℃延伸10 min，4℃停止。取25 μL PCR产物于10 g/L琼脂糖凝胶中电泳（116 V），20 min后在紫外灯下观察结果并拍照。

胶回收PCR产物，与pEasy-T1载体连接，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，在LB培养基中过夜培养（37℃、200 r/min），次日从转化平板上挑取单克隆菌落，以 Z1444（up）、Z1444(down）为引物进行 PCR筛选鉴定阳性菌株，阳性克隆送生工生物工程有限公司测序。

1.3 表达菌株pET-28a（+）-Z1444/BL21的构建

1.3.1 表达质粒pET-28a（+）-Z1444的构建 将测序正确的克隆质粒pEasy-T1-Z1444用NdeⅠ、XhoⅠ双酶切，得到目的片段Z1444，胶回收，用T4DNA连接酶连接经同样双酶切处理的pET-28a（+）载体，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在LB培养基中过夜培养（37℃、200 r/min），次日从转化平板上挑取单克隆菌落，以Z1444（up）、Z1444（down）为引物进行PCR初筛，NdeⅠ、XhoⅠ双酶切复检，鉴定阳性菌株，阳性克隆送生工生物工程有限公司测序。

1.3.2 表达菌株的构建 将测序正确的重组质粒pET-28a（+）-Z1444转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，在LB培养基中过夜培养（37℃、200 r/min），次日挑取单克隆，以Z1444（up）、Z1444（down）为引物进行PCR鉴定。

1.4 目的蛋白的表达与纯化

1.4.1 蛋白表达 鉴定为阳性的单克隆菌株和转入空载体的阴性对照菌接入新鲜LB培养基，37℃培养至对数生长期前期时（D600nm约为0.4），加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，25℃、200 r/min条件下诱导6 h，5000 r/min离心20 min收集菌体，用1/5体积的PBS重悬菌体，400W功率超声4个循环（工作3 s，间隔5 s，循环99次），破碎菌体细胞，5000 r/min离心15 min，分离上清、沉淀，各取20 μL样品进行SDSPAGE（5%浓缩胶和15%分离胶；恒压110 V，浓缩15 min；恒压180 V，分离1 h）。

1.4.2 蛋白纯化 超声裂解后上清过镍柱（His⁃Trap FF crude 5 mL）纯化，用400 mmol/L咪唑洗脱液洗脱，取纯化后蛋白20 μL进行SDS-PAGE。

1.5 纯化蛋白的功能初步验证

1.5.1 His标签蛋白的Western印迹 收集纯化的蛋白，进行15%SDS-PAGE鉴定，并电转移到醋酸纤维素（PVDF）膜上，用3%BSA封闭（37℃、2 h），加入1∶1000稀释的兔源抗His抗体（一抗），4℃过夜，再加入1∶1000稀释的HRP酶标二抗（抗兔），室温轻摇1 h，用TBST洗膜后，在BIO-RAD凝胶成像系统中化学发光显影。

1.5.2 纯化蛋白的体外酶活实验 GenBank中Z1444的蛋白功能注释为丝/苏氨酸蛋白激酶，因此选取丝/苏氨酸通用底物髓鞘碱性蛋白（myelin ba⁃sic protein，MBP）进行测定[14]。首先将 MBP溶于酶活实验低渗缓冲液［20 mmol/L Hepes（pH7.4），150 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2］中，然后加入Z1444蛋白，补加50 μmol/L ATP，于30℃反应30 min后收集产物，进行15%SDS-PAGE后电转移至PVDF膜上，用3%BSA封闭（37℃、2 h），加入1∶1000稀释的鼠源磷酸丝氨酸/苏氨酸抗体（一抗），4℃过夜，再加入1∶1000稀释的HRP酶标二抗（抗鼠），室温轻摇1 h，用TBST洗膜后，在BIO-RAD凝胶成像系统中化学发光显影。

2 结果

2.1 pET-28a（+）-Z1444原核表达质粒的构建与鉴定

以EHEC O157∶H7全菌裂解液为模板，Z1444（up）、Z1444（down）为引物PCR扩增Z1444基因，经琼脂糖凝胶电泳，获得约1047 bp的DNA片段，与预期一致（图1）。将pET-28a（+）载体与PCR鉴定阳性的质粒pEasy-T1-Z1444同时经NdeⅠ/XhoⅠ双酶切，各自胶回收产物用T4DNA连接酶连接，转入大肠杆菌DH5α，涂板后挑取克隆酶切鉴定，可切出2条片段，分别为长度约5000 bp的空载体pET-28a（+）和1047 bp的Z1444条带，重组质粒pET-28a（+）-Z1444作为双酶切前对照，符合预期结果（图2）。完成后质粒送生工生物工程有限公司测序，测序结果与NCBI数据库收录的相应碱基序列的一致率为100%（序列略）。

2.2 重组Z1444的表达和纯化

重组菌pET-28a（+）-Z1444/BL21经IPTG诱导表达后制备全菌裂解液，分离沉淀和上清，取样品进行SDS-PAGE鉴定，可见上清中在相对分子质量约38×103处有明显的蛋白条带，与预期相符（图3），而沉淀中对应位置并无显著条带。转入空载体的菌体裂解液作为阴性对照，经相同处理后，对应位置无目的条带。因此，可以判断获得了原核表达的目的蛋白，且以可溶性形式存在。将重组菌全菌裂解液上清经镍柱纯化，去除大量杂蛋白，得到较纯的蛋白条带（图4），所得蛋白溶液经反复冻融后没有出现沉淀，可供后续试验使用。

图1 PCR扩增Z1444基因

图2 重组质粒pET-28a（+）-Z1444的酶切鉴定

2.3 重组Z1444的丝/苏氨酸激酶活性初步验证

将纯化的Z1444蛋白进行Western印迹，检测His-Z1444蛋白表达，结果见图5。同时将丝/苏氨酸激酶通用磷酸化底物MBP与Z1444蛋白混合后补加ATP，30℃孵育30 min，完成酶促反应，用磷酸丝/苏氨酸抗体进行Western印迹检测，可见Z1444蛋白不仅可以磷酸化通用底物MBP，且Z1444蛋白本身发生了自磷酸化现象（图6）。

3 讨论

图3 重组菌pET-28a（+）-Z1444/BL21的蛋白表达

图4 重组Z1444蛋白的纯化

图5 Western印迹检测His-Z1444蛋白的表达

图6 纯化的Z1444蛋白的丝/苏氨酸激酶活性验证

我们通过寡核苷酸互补原理双向设计引物，从大肠杆菌O157∶H7 EDLL933全基因组中钓取出Z1444基因，利用PCR扩增目的基因，选用带有His标签的pET载体系统构建了重组表达质粒，然后以大肠杆菌BL21（DE3）作为宿主菌进行蛋白表达。我们希望得到高水平表达的重组蛋白，且最好为可溶性形式，以利于蛋白纯化及后续活性验证。为此，我们进行了表达条件的优化。在较高温度如常规37℃诱导表达时发现重组蛋白大多形成包涵体，于是进行了温度梯度诱导实验，发现25℃诱导时重组蛋白为可溶性表达，产物表达量占上清总蛋白的40%左右。后续采用亲和层析NTA His结合树脂纯化蛋白，配制6种浓度的咪唑洗脱液进行蛋白梯度洗脱纯化，发现400 mmol/L咪唑洗脱液具有优势，可除去大部分杂蛋白，特异性较好，可获得纯度较高的蛋白。Z1444蛋白在原核系统中的高效可溶性表达，为后续蛋白活性研究提供了良好的实验材料。

O157∶H7是EHEC的主要血清型，能引起人的出血性结肠炎和溶血性尿路综合征[15]。EHEC可以产生毒力极强的志贺毒素，且具有黏附上皮细胞的能力，感染人或动物时黏附到肠黏膜上皮细胞，然后在此定居，释放外毒素，从而引起疾病[16-17]。毒力岛是与细菌致病性和毒力因子密切相关的基因簇[18-19]，获得EHEC O157：H7毒力岛上某些基因的可溶性原核表达，为研究该基因的功能奠定了基础，同时有助于探索基因与菌株致病性之间的相互关联。

综上所述，我们构建了pET-28a（+）-Z1444重组表达载体，并筛选获得了高效原核表达工程菌，建立了简便可行的蛋白纯化工艺，获得了浓度纯度在90%以上的Z1444蛋白，为进一步研究Z1444蛋白在大肠杆菌与宿主相互作用时所起的功能奠定了基础。我们还通过Western印迹验证了GenBank对Z1444蛋白的功能注释，发现该蛋白不仅可以磷酸化通用底物MBP，而且蛋白本身也发生自磷酸化现象。考虑到这些特殊的酶活效应，对其蛋白生物学活性的进一步验证显得尤为重要，这将有助于了解功能未知毒力因子在细菌感染时的作用机制。

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