人MDM2基因真核表达载体的构建及其与p53的相互作用

叶晨阳，徐建明，林莉，王岩，葛飞娇，赵传华，李珊珊，付亚莉，李志强

军事医学科学院 附属医院消化肿瘤科，北京 100071

人MDM2（murine double minute 2）基因定位于12号染色体，广泛表达于人体的多个器官，在骨骼肌中的含量最高，其次为肝、肺、胰等，与细胞基本生理活动有关。MDM2蛋白包含5个保守区，从N端开始，分别为Ⅰ区（19～102氨基酸残基，是MDM2与p53相互结合部位）、Ⅱ区（181～185残基，为核定位序列）、Ⅲ区（221～272残基，是含有40%谷氨酸和精氨酸残基的高度酸性区域，能与核糖体L5蛋白及5S rRNA结合）、Ⅳ区（305～322残基，含有1个锌指结构）和Ⅴ区（438～478残基，含有1个环指结构，可介导蛋白质-蛋白质的相互作用，也可以与DNA或RNA结合）[1]。MDM2具有泛素化连接酶的功能，已报道的MDM2蛋白最重要的功能是与p53蛋白直接结合形成p53-MDM2复合物，介导p53通过泛素-蛋白酶体途径降解，从而抑制p53的功能[2-4]。MDM2在细胞中的其他功能研究相对较少。

我们拟构建MDM2真核表达载体，并验证其与p53的相互作用，为进一步研究MDM2蛋白在细胞内的功能提供基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚肾293T细胞购自ATCC；pcDNA3.0-Flag载体购自Invitrogen公司；VigoFect为威格拉斯生物技术有限公司产品；限制性内切酶、DNA连接酶、PCR试剂购自TaKaRa公司；DMEM、小牛血清购自Gibco公司；质粒提取、胶回收、PCR回收试剂盒购自Pro⁃mega公司；测序由华大生物技术有限责任公司完成。

1.2 Flag-MDM2重组质粒的构建与测序

以人乳腺文库为模板，PCR扩增MDM2基因的CDS序列。正向引物为5'-CGCGGATCCATGGTGA GGAGCAGGCAAATGTG-3'，反向引物为5'-CGG AATTCCTAGGGGAAATAAGTTAGCACAAT-3'。扩增条件：95℃预变性5 min，以95℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1.5 min行30个循环，72℃延长7 min。用胶回收试剂盒回收PCR产物。用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pcDNA3.0-Flag载体，经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收载体大片段；将PCR片段回收后再用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，形成带有粘性末端的双链，用T4DNA连接酶连接入pcDNA3.0-Flag载体，转化大肠杆菌DH5α，挑选克隆，振荡培养后提质粒，用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定，鉴定正确的克隆进行测序。

1.3 哺乳动物细胞转染和Western印迹检测

将293T细胞接种于6 cm皿中，接种量以转染时细胞密度达到80%为宜，24 h后进行转染。将4 μL VigoFect与 200 μL NaCl混合，再将总量为 5 μg的重组质粒与200 μL NaCl混合，然后将上述2种溶液轻轻混合，室温放置15 min，加入6 cm皿中，24 h后收集细胞蛋白，加入2×SDS加样缓冲液，煮沸10 min，12 000 r/min离心5min，取上清液进行SDS-PAGE后，转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉于4℃封闭1 h，加入用5%脱脂奶粉以1∶5000稀释的用HRP标记的Flag抗体，室温轻摇1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，用化学发光法显色5 min，压片显影。

1.4 免疫共沉淀

转染24 h后收集细胞，用0.5 mL IP缓冲液裂解细胞，冰浴30 min；超声波破碎，4℃、12 000 r/min离心10 min，取上清，留30 μL做Input；取一定量的偶联抗体的磁珠，用IP缓冲液平衡3次，每次10 min；取30 μL磁珠加到细胞裂解物中，4℃结合4 h；用0.5 mL IP缓冲液洗涤沉淀物4次，每次10 min；沉淀加入30 μL 2×SDS蛋白加样缓冲液，煮沸10 min变性，进行SDS-PAGE；用抗另一种蛋白的抗体进行Western印迹分析，检测2种蛋白质之间是否存在相互作用。

2 结果

2.1 Flag-MDM2重组质粒的构建与鉴定

以人乳腺文库为模板，PCR扩增人MDM2的编码序列，获得长1494 bp的DNA片段，与预期大小一致（图1）。将PCR产物用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后与同样经这2种酶切的pcDNA3.0-Flag载体连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选克隆，进行菌液PCR鉴定，所得的阳性克隆提质粒经酶切鉴定，可切出2条长度分别约为5000和1494 bp的条带，5000 bp条带为pcDNA3.0-Flag载体，1494 bp条带为MDM2，符合预期结果（图2）。序列测定结果表明，插入载体的DNA序列与人MDM2基因的编码序列完全一致（序列略）。

2.2 Flag-MDM2在293T细胞中的表达

将构建的Flag-MDM2重组质粒和空载体分别转染293T细胞，24 h后收细胞，提取蛋白进行SDSPAGE，Western印迹检测构建的Flag-MDM2是否表达。结果显示，转染Flag-MDM2的细胞裂解物能在相对分子质量约60×103处检测到明显的特异性条带，而转染空载体的细胞裂解物无条带（图3），说明Flag-MDM2重组蛋白在293T细胞中能够成功表达。

2.3 Flag-MDM2与p53存在相互作用

文献报道MDM2能够结合并降解p53，因此，我们利用免疫共沉淀实验验证了构建的带Flag标签的MDM2与带Myc标签的p53的相互作用，结果如图4，在细胞内p53可以和MDM2结合，而不能与阴性对照Flag空载体结合，说明MDM2与p53存在特异的相互作用，与文献报道一致。

图1 PCR扩增人MDM2的编码序列

图2 Flag-MDM2的BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切电泳图谱

图3 Western印迹检测Flag-MDM2的表达

图4 Flag-MDM2与p53存在相互作用

3 讨论

我们扩增了人MDM2基因，并连接到带有Flag标签的真核表达载体上，经过酶切和测序鉴定克隆构建成功，转染293T细胞证明Flag-MDM2基因成功表达。根据文献报道，利用免疫共沉淀实验验证了Flag-MDM2与p53的相互作用，证明Flag-MDM2载体表达的蛋白具有生物学功能。

MDM2蛋白由497个氨基酸残基构成，在胶质母细胞瘤[5]、脂肪肉瘤[6]、黑色素瘤[7]、乳腺癌[8]、食道癌[9]、骨肉瘤[10]、结直肠癌[11-12]等多种肿瘤中过量表达。研究表明，MDM2在肿瘤中发挥癌基因的功能，MDM2的转基因小鼠实验证实MDM2会诱导小鼠肿瘤的发生[13-14]。p53是目前研究最深入的抑癌基因，广泛参与细胞凋亡、细胞周期、基因组稳定性等肿瘤发生发展的关键步骤。MDM2癌基因功能的发挥主要是通过泛素-蛋白酶体途径降解抑癌基因p53，抑制p53的转录活性[15]。MDM2在肿瘤中的其他功能及分子机制研究较少，我们构建的Flag-MDM2真核表达载体将为探讨MDM2的其他功能奠定基础。

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