肿瘤内皮标志物8同型物Ⅰ基因真核表达载体的构建及其在HEK293F细胞中的表达

刘羽，高丽华，邵勇，王友亮，胡显文，陈惠鹏

军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100071

肿瘤内皮标志物8（tumor endothelial marker 8，TEM8）又称炭疽毒素受体1（anthrax toxin receptor 1，ANTXR1），是Ⅰ型跨膜蛋白，其确切的生理学功能还未知。TEM8蛋白共有3个变体，最长变体TEM8同型物（isoform）Ⅰ是由564个氨基酸残基构成的单次跨膜糖蛋白，具有较长的富集脯氨酸的胞质尾部，相对分子质量约为（80～85）×103，包括胞外vWA结构域和一个巨大的胞质尾部[1]。体外研究表明，TEM8在多种内皮细胞功能中具有重要作用，其胞外区能结合细胞外基质蛋白，同样也能结合炭疽毒素保护性抗原。临床样本研究表明TEM8在肿瘤内皮细胞中过表达，而在正常成熟组织中表达零星不规则且远远低于肿瘤内皮组织[2]。这些发现均暗示了在成熟细胞内TEM8高表达往往是由于异常的脉管生成，如肿瘤脉管系统，即可以将TEM8作为靶向肿瘤内皮组织的治疗靶点。

TEM8作为炭疽毒素受体，介导炭疽毒素进入宿主细胞。但在没有炭疽毒素存在的情况下，TEM8在细胞中的生理功能尚不清楚。在本研究中，我们构建了pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP真核表达载体，并稳定转染HEK293F细胞，以此得到稳定表达TEM8蛋白的TEM8-EGFP/HEK293F细胞系，为后期实验研究奠定了良好的基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚胎肾细胞HEK293F由本实验室贮存；大肠杆菌Trans10感受态细胞购自全式金公司；真核表达载体pcDNA3.1（+）-EGFP由本研究室构建；编码TEM8基因所需质粒pcDNA3.1（+）-MYC-TEM8由本实验室构建；Taq DNA聚合酶购自奥赛博公司；DNA限制性内切酶、快速连接酶均购自NEB公司；质粒小量制备盒及DNA胶回收试剂盒为天根公司产品；DMEM/F12培养基购自Hyclone公司；新生胎牛血清（FBS）购自杭州四季青公司；G418、转染试剂LipofectAMINE 2000均购自Life Technologies公司。

1.2 重组质粒pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP的构建

以质粒pcDNA3.1（+）-MYC-TEM8为模板PCR扩增得到TEM8基因序列全长（1668 bp，优化后）。上游引物为T8up1（5'-CCCAAGCTTACCATGCGGG CACTGCTGGCCAGACTGCTGCTGTGCGTGCTGGTG-3'，含HindⅢ酶切位点）、T8up2（5'-GCTGCTGTGC GTGCTGGTGGTGTCTGACAGTAAAGGGGGCGGAA GGCGAGAAGAC-3'），下游引物为 T8down（5'-CGC GGATCCCTTGGCCTTGGAGGGGGTC-3'，含 BamHⅠ酶切位点）（引物由Life Technologies公司合成）。首先用上游引物T8up2和下游引物T8down以质粒pcDNA3.1（+）-MYC-TEM8为模板进行PCR反应扩增，以回收后的产物为模板，采用上游引物T8up1和下游引物T8down再次进行PCR反应扩增，凝胶回收得到TEM8基因。将TEM8基因和 pcDNA3.1（+）-EGFP载体分别以HindⅢ和BamHⅠ双酶切，酶切产物纯化后连接并转化大肠杆菌Trans10感受态细胞后，将其均匀接种在含氨苄西林的LB固体培养基中过夜培育，选取PCR验证阳性的菌落进行测序。

1.3 细胞培养及重组质粒转染

HEK293F细胞以1×105/mL的密度接种于6孔培养板，于 37℃、5%CO2孵箱中培养 48 h；用 Lipo⁃fectAMINE 2000转染试剂将pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP质粒转染HEK293F细胞，用含0.5 mg/L G418、8%FBS的DMEM选择性培养基加压筛选，采用有限稀释法制备单克隆细胞，最终得到稳定表达TEM8蛋白的单克隆细胞系TEM8-EGFP/HEK293。

1.4 细胞表达蛋白的鉴定

过表达TEM8的TEM8-EGFP/HEK293细胞及HEK293细胞生长至密度约90%时裂解细胞，裂解液于95℃变性5 min，并等量上样，经SDS-PAGE后恒压电转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭2 h，加入用5%脱脂奶粉以1∶1000稀释的抗TEM8抗体ab21270，于静音混合器上37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，用辣根过氧化酶偶联的羊抗兔IgG二抗1∶5000稀释，37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，室温避光显色5 min，压片显影。

2 结果

2.1 重组质粒pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP的构建、酶切鉴定及DNA序列测定

经2步PCR扩增获得目的基因TEM8（图1）。经HindⅢ和BamHⅠ双酶切及连接转化，得到含有目的基因的重组质粒，酶切鉴定证明重组质粒携带目的基因（图2），测序结果显示pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP重组质粒序列无误（图3为质粒示意图）。

2.2 重组质粒 pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP在HEK293F细胞中的表达

pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP转染阳性细胞经G418加压筛选和有限稀释克隆，在96孔板中形成多个单克隆并标记。将阳性克隆于24孔板、6孔板、25 cm2培养瓶中逐级扩大培养，并在荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达，最终得到稳定表达TEM8蛋白的阳性细胞系（图4）。

2.3 细胞的蛋白表达鉴定

图1 重组质粒pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP的PCR扩增结果

图2 重组质粒pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP的酶切鉴定

为验证阳性细胞系所表达的新生蛋白是否为目的基因的表达产物，选择绿色荧光较强的2株阳性单克隆细胞系 TEM8-EGFP/HEK293F（1）、TEM8-EGFP/HEK293F（5）进行Western印迹，结果如图5，在相应位置出现2条条带，相对分子质量约为85×103，证明阳性细胞系表达TEM8蛋白。

3 讨论

近年来，靶向破坏肿瘤脉管系统在肿瘤生物学和治疗学领域受到众多研究者的关注。肿瘤血管化提供肿瘤持续发生发展所必需的氧及营养物质[3]。肿瘤通过血管获得潜在的迁移能力，并且由此能够缓解其无限增殖导致的低氧环境。若这种血管发生受到抑制或改变，则肿瘤无法从新生脉管系统中得到营养供给，这些肿瘤组织将会饥饿而死。因此，靶向脉管生成而治疗肿瘤的发生发展显得尤为重要。同时这些脉管网络受肿瘤微环境影响，导致多种蛋白表达改变，应该存在一种新的因子能够破坏或阻断肿瘤血管的生长[4]。经过一系列分子技术探究，得到一些集中过表达的蛋白，其中较为特别的就是肿瘤内皮标志物8，其在多种肿瘤脉管中高表达，并且在种属间高度保守[5]。

图3 pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP重组质粒图谱

图4 稳定表达TEM8蛋白的TEM8-EGFP/HEK293F细胞系

图5 Western印迹检测2株TEM8-EGFP/HEK293F单克隆细胞系中TEM8的表达

TEM8同型物Ⅰ具有结合胞外基质的胞外区及富含Cys的胞质尾部。其胞外区主要由包含一个金属离子结合位点（MIDAS）的vWA结构域组成，与整合素的结构域Ⅰ有很高的同源性。体外研究发现TEM8在多种内皮细胞中具有一定作用[6]，且其胞外区能结合胞外基质蛋白[7]及炭疽毒素保护性抗原[8]。已有研究表明，TEM8具有调节内皮细胞迁移[9]、黏附[10]及肿瘤血管生成的功能[11]。有部分研究表明，TEM8具有调节内皮细胞迁移和黏附的功能。

我们构建、表达了TEM8同型物Ⅰ与EGFP的融合蛋白，目的在于进一步研究TEM8的正常生理功能及其在肿瘤血管形成中的机制。EGFP的表达可以快速并准确地显示TEM8在细胞内的表达及定位，大大缩短了筛选TEM8蛋白表达阳性细胞系的时间，并可以进一步通过活细胞工作站直接观测不同细胞因子刺激下TEM8在细胞中的定位。实验结果证明真核载体转染后能使低表达TEM8的HEK293F细胞显著表达TEM8蛋白。以上结果为进一步研究TEM8的生理功能等奠定了基础。

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