人丝氨酸蛋白酶抑制因子抗肿瘤作用的研究进展

王雪蕾，伦永志

大连大学 医学院，辽宁省高校生物物理学重点实验室，辽宁 大连 116622

丝氨酸蛋白酶抑制因子（serine protease inhibitor，Serpin）具有保守的核心结构，由包含3 个β折叠（A、B、C）和7～9 个α螺旋的370～390 个氨基酸残基组成，因而被定义为Serpin 蛋白超家族。该蛋白家族成员在细菌、植物、多细胞生物组织及某些病毒中均有发现。Serpin 可在胞内、胞外，甚至细胞核内发挥生物学活性。在人体内，血浆Serpin 占血循环总蛋白的2%～10%，在凝血-抗凝作用、免疫炎症反应、激素转运、神经生长及血药调节方面起重要作用[1]。Serpin 的其他功能包括抗多蛋白激活的组织保护作用、调节血管生成反应、影响细胞或组织的增殖和凋亡及调节细胞外基质的重塑，还有很重要的功能就是本文所述与肿瘤生长、侵袭和扩散有关的功能。部分Serpin的功能与蛋白酶抑制相关，而某些Serpin只保持了其基本结构，如卵白蛋白和血管紧张素原，它们的抑制作用与蛋白活性无关。

1 丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制因子在肿瘤生长和代谢中的作用

Serpin 的蛋白酶抑制作用依赖于它本身的独特结构，即反应活性部位环（RSL），它含有选择性蛋白酶识别位点。RSL 是由约17 个氨基酸残基在β折叠A 与C 之间形成的环，RSL 暴露在Serpin 的表面，可以与目标蛋白酶以非共价键的结合形成Serpin-蛋白酶中间体，从而抑制蛋白酶的活性。目标丝氨酸蛋白酶在Serpin 上P1-P1'键间切割RSL，同时丝氨酸蛋白酶与P1 残端共价结合，而切割后RSL 插入β折叠A，同时携带丝氨酸蛋白酶到Serpin 的另一端。RSL 的构型变化改变了丝氨酸蛋白酶的活性位点，导致丝氨酸蛋白酶受限，从而失去了蛋白酶水解活性。

恶性肿瘤的发生是由于多种生物活动失调导致的。肿瘤细胞及其周围间质细胞的多种生物活动均可促进原发性肿瘤的生长，该过程包括了丝氨酸蛋白酶及其抑制因子的参与。其中一种丝氨酸蛋白酶是尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA），它可以激活纤溶酶原转化为有活性的蛋白，即纤溶酶。uPA和组织型纤溶酶原激活剂（tPA）伴有纤溶酶，可活化基质金属蛋白酶（MMP），继而激活MMP，使胶原蛋白和弹性蛋白降解酶。尿激酶型纤溶酶原受体（uPAR）表达在迁移细胞的前缘，uPA 与受体结合后诱导细胞外基质（ECM）发生局灶性蛋白水解，促进肿瘤细胞、免疫细胞及血管内皮细胞的迁移。同时，uPAuPAR 复合物通过整合素和其他胞膜受体间的相互作用发出胞内信号，与脂筏复合物uPAR 连接，调节细胞粘连、迁移和增殖作用。由于uPA-uPAR 复合物的作用多样化，该复合物与多种人类癌症疾病相关，且Serpin 可调节uPA-uPAR 系统，所以该过程可以影响肿瘤的发生发展[2]。非抑制性Serpin 可能通过其他不同机制，对肿瘤生长、凋亡、侵袭和血管再生也有一定影响。下面将对各种与肿瘤相关联的人Serpin进行更深入的阐述。

2 纤溶酶原激活剂抑制因子1（PAI-1，Serpine-1）

PAI-1 是抑制性Serpin，可以抑制uPA和tPA 的活性。PAI-1 在血循环中的主要调节纤溶作用，当玻连蛋白和肝素同时存在时，PAI-1 可以抑制凝血酶的活性。当出现血管损伤和/或多种炎性细胞因子时，血液中PAI-1 水平会有所提高。在血栓形成过程中，PAI-1 从血小板中释放，与tPA 结合并抑制其作用，阻止血栓中纤维蛋白溶解。然而在血管外，PAI-1 具有通过抑制tPA 调节基质重塑和细胞黏附的作用。

基于uPA-uPAR 复合物对癌症进展具有明确生物作用，有人提出预测，像PAI-1 的uPA 抑制因子具有抗肿瘤活性。然而，循环血液中PAI-1 水平的提高与几种人类恶性肿瘤的不良预后成正相关[3]。虽然这一结论暂时尚未有明确解释，但可以推测，PAI-1 可能促进某种促进肿瘤生长的介质的释放，如促肿瘤介质；也可能提高某种阻止肿瘤进展的天然宿主水平。据称，PAI-1 在低浓度时可以促进血管再生，而在较高水平则体现抑制血管再生的作用，因此可以得出PAI-1具有一个潜在的抗肿瘤生长或促肿瘤生长的作用。多方数据显示，PAI-1 在调节恶性肿瘤细胞迁移、血管再生、恶性肿瘤细胞凋亡和增殖的作用中，最后的效应可能是促进肿瘤生长，也可能是抑制肿瘤生长。

细胞迁移需要“黏附-脱离-再黏附”的循环过程，该过程由uPAR-整合素共受体控制[4]。PAI-1 与uPAR和整合素竞争性结合玻连蛋白诱导细胞脱离。PAI-1 与uPA-uPAR 复合物结合，通过低密度脂蛋白受体相关蛋白-1（LRP1）介导的内吞作用，引发uPA-uPAR 复合物内化，从而去黏附[5]。PAI-1 也可以通过LRP1 介导整合素的内化，使整合素从ECM 脱离。内化后的整合素和uPAR 再次分布在迁移细胞的前缘，为细胞的再黏附和迁移提供支持。此外，不同形式的PAI-1，包括活化的、潜伏期的以及裂解的，均可与LRP1 直接作用，通过酪氨酸激酶信号传导途径及转录激活分子通路的激活，增强细胞运动。在人结直肠腺癌细胞系SW620 的体外实验中，基质限制性PAI-1 对该细胞的变形迁移有至关重要的作用[6]。

被细胞外基质弹性蛋白裂解的PAI-1、纤溶酶及MMP3均可直接与LRP1结合，通过丝裂原活化蛋白激酶（MAP）途径诱导产生胞内信号，同样可以促进细胞增殖。

最新实验数据也表明，PAI-1 在部分人恶性肿瘤细胞，如纤维肉瘤细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞及早幼粒细胞性白血病细胞中，具有抗凋亡作用[7-9]。实验中将PAI-1 缺陷的小鼠纤维肉瘤细胞与野生型纤维肉瘤进行对比，发现缺陷组细胞对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和广谱化疗药物具有更高的敏感性[9]。

Bajou 等通过PAI-1 缺陷小鼠实验证明，PAI-1在移植恶性角质细胞的侵袭和血管再生过程中起关键作用[10]。如前所述，在肿瘤生长的微环境中，PAI-1 在生理（低）浓度下促进血管再生，而在高浓度则抑制血管再生[11]。有研究认为PAI-1 的促血管再生作用与纤溶酶介导的Fas 配体裂解有关。Fas 配体裂解引起PAI-1 抑制，从而阻止上皮细胞凋亡[12]。在Nishioka 等的实验性治疗研究中，利用RNAi 技术敲除人胃癌细胞株的PAI-1 基因，建立一个PAI-1缺陷人胃癌细胞株，移植到小鼠腹腔后，缺陷组肿瘤生长大幅降低，且血性腹水明显减少，提示PAI-1的潜在作用可能是拮抗抑制恶性肿瘤细胞的转移[13]。

3 乳腺丝抑酶（Maspin，Serpinb-5）

Maspin 是一种非抑制性Serpin，具有重要的生理功能和肿瘤抑制作用。Maspin在发育早期的作用尤为重要，通过基因敲除该基因的小鼠可致胚胎死亡[14]。Maspin 在早期发挥作用主要是通过调节滋养层细胞入侵。成年后，Maspin在多组织中表达，包括上皮细胞、乳腺上皮细胞、内皮细胞及眼角膜基质细胞。有研究发现，Maspin 在孕期和哺乳期乳腺形态形成过程中有重要作用，且可以调节角膜伤痕愈合过程[15-16]。

Maspin 在很多类型的恶性肿瘤中表达增强，而且与好的预后相关，这一发现体现该Serpin 具有肿瘤抑制作用，且与PAI-1 不同[17]。但是，同样也有大量临床数据显示Maspin 在部分恶性肿瘤中有促肿瘤生长的功能。该领域的研究人员表示，Maspin 在功能上的差异是因为Maspin 在不同恶性肿瘤细胞中定位不同[18]。例如，定位在细胞核的Maspin 具有抑肿瘤作用，而胞质内的Maspin 则体现促肿瘤转移作用。因此，Maspin在恶性肿瘤中的作用，必须在特定组织中对Maspin 定位及其他相关因素进行测定才能有结论。

Maspin的肿瘤抑制作用与肿瘤细胞迁移和侵袭的抑制、血管再生的抑制，以及肿瘤细胞对凋亡的高敏感性密切联系。Maspin 处理后的乳腺癌细胞中，Rac1 蛋白和细胞分裂周期蛋白Cdc42 活性降低，引起受损的细胞骨架重排并发生细胞迁移[19]。Maspin调节细胞迁移的作用机制可能是改变整合素的表达模式和功能，人乳腺癌细胞经重组Maspin（rMaspin）处理后，α5β1和α3β1整合素表达上调，α2β1整合素表达减少。整合素表达模式的这一改变，可能提高细胞对纤连蛋白的黏附作用，使基质富含纤连蛋白，从而减少细胞侵袭[20]。

内源性及转染的Maspin 基因表达后，均能提高乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞及骨肉瘤细胞对星状孢菌素的敏感性。但是，经rMaspin处理的恶性肿瘤细胞没有这种效果[21]。

Maspin的肿瘤抑制作用同样源于其抗血管再生作用。在前列腺癌体内模型中，不论是经rMaspin处理，还是内源性Maspin 表达，均能有效抑制新血管形成。大量临床数据也显示，Maspin在结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、喉癌、头颈部鳞状细胞癌及黑色素瘤中，具有抑制新血管形成的作用。Maspin的抗新血管形成作用与其促进细胞凋亡，同时抑制内皮细胞迁移有关。Li 等研究发现，当腺病毒工程菌在血管内皮细胞靶向表达Maspin 时，肿瘤内血管将变成疏松多孔结构，且易渗透，而血管的渗透性增加极有可能是由血管内皮细胞发生凋亡引起的[22]。血管内皮细胞Maspin 过表达，将提高Bax 水平，同时降低Bcl-2 水平。rMaspin 可增强内皮细胞黏附作用，同时通过整合素信号传导途径抑制内皮细胞迁移。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）经rMaspin 处理后，可提高整合素连接酶活性，并提高黏着斑激酶（FAK）的磷酸化作用。rMaspin 作用后的HUVEC 在碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）刺激培养下，Rac1 蛋白和Cdc42 活性水平急剧下降，引起黏着斑分离减少，内皮细胞迁移受到抑制。

综上Maspin 的抗肿瘤作用，不论是单独用药还是联合用药，Maspin 具有发展为可行性抗癌药物的潜力。但Maspin 在不同肿瘤类型和不同分期，以及在细胞中定位不同时，其抗肿瘤效果不尽相同，因此，Maspin作为治疗药物的前提是，必须根据肿瘤类型及肿瘤分期具体分析后选用药物。

4 色素上皮细胞衍生因子（PEDF，Serpin-f1）

色素上皮细胞衍生因子（PEDF）的相对分子质量约为50×103，是在人体内广泛表达的分泌性非抑制性Serpin。PEDF 最早于人类胎儿的视网膜色素上皮细胞中被发现。PDEF具有广泛的生物学活性，包括免疫调节、细胞保护、细胞分化和肿瘤抑制。体外实验表明，在大多数肿瘤和肿瘤细胞中，PEDF 有不同程度的表达缺失或下调[23]。此外，动物体内模型实验及大量临床数据显示，低PEDF 表达水平与肿瘤侵袭性增加和癌症的不良预后有关，如前列腺肿瘤、胰腺癌、卵巢癌、骨肉瘤、肝细胞癌及肾母细胞瘤，提示PEDF具有肿瘤抑制作用。

PEDF 的抗肿瘤活性，是因为其具有抗增殖、促分化、促凋亡及抗血管生成作用。体外组织培养的几种人恶性肿瘤细胞经PEDF 处理后，表现为增殖减少。体外培养的人肺癌细胞株A549，通过核酶将其PEDF 表达下调后，A549 增殖速度急剧上升[24]。此外，PDEF 引起神经母细胞瘤分化，使其向低恶性表型发展[25]。

PEDF 可以通过促进肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤生长。PEDF 过表达时，可诱导黑色素瘤细胞G361凋亡增加，该凋亡作用可通过中和Fas 配体阻断，以此说明PEDF 诱导凋亡至少有一部分是通过Fas/FasL 信号途径。可以肯定的是，PEDF 可以上调Fas配体的表达，从而诱导血管内皮细胞凋亡[26]。此外，PEDF 也可能通过调节Bcl-2 蛋白家族诱导产生凋亡作用。Zhang 等发现，神经胶质瘤细胞A172和U87在经PEDF 处理后均有细胞凋亡发生，该促凋亡作用与p53和Bax上调，以及Bcl-2下调有关。PEDF的促凋亡作用还有可能是通过下调细胞FLICE 抑制蛋白（cFLIP）表达而体现的，cFLIP 能禁止caspase-8的作用，从而阻止细胞凋亡的启动[27]。

PEDF 是迄今发现的作用效果最明显的内源性血管形成抑制因子。在很多人类恶性肿瘤，包括前列腺癌、胰腺癌、神经胶质瘤、淋巴血管瘤及非小细胞肺癌等中，PEDF 水平下降，同时可见肿瘤内具有更高的瘤内血管密度（MVD）及更强的侵袭性。PEDF 主要通过以下2 种方式体现其抗血管形成作用。第一，PEDF通过激活FasR/FasL途径，诱导新生血管的内皮细胞发生凋亡[28]；第二，PEDF 通过中和作用，抵消血管内皮生长因子（VEGF）的作用。例如，VEGF和bFGF 引起活化T 淋巴细胞核因子（NFAT）的去磷酸化，激活促新血管形成的转录；而PEDF 可以通过c-Jun 氨基端激酶（JNK）依赖途径对NFAT 重新磷酸化，失活其血管再生作用。PEDF 的抗血管再生活性只靶向作用于新生血管系统，而对已存在的血管无作用[29]，因此，PEDF 具有潜在抗癌价值，阻止有利于肿瘤生长的新血管再生，达到靶向治疗癌症效果。研究证实，黑色素瘤异种移植动物模型中PEDF 过表达，可以明显减少瘤内新生血管密度，有效抑制肿瘤生长和转移。

PEDF 具有多个受体，其中一个（PEDF-R）已确定是PNPLA2 蛋白家族成员。该跨膜蛋白对PEDF具有高特异性和高亲和力，与PEDF 结合后，PEDFR 体现出有效的磷酸酶A2 活性，从胞膜释放脂肪酸，随后启动包括p53 途径在内的信号传导通路。但是，PEDF在生理条件和恶性肿瘤情况下行使功能的分子通路和机制在很多方面仍有待进一步阐明。

PEDF 的多靶点抗肿瘤作用使其极有可能成为优选的抗肿瘤药物。在不同肿瘤模型中，如前列腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌及黑色素瘤等，已有PEDF 的实验性治疗。该实验的前期研究证实，PEDF过表达可显著抑制肿瘤生长、侵袭和/或血管再生。

5 神经源性丝氨酸蛋白酶抑制因子（neuroserpin，Serpini1）

神经源性丝氨酸蛋白酶（neuroserpin，NSP）是在鸡神经轴突培养中首次发现的一种分泌性蛋白，随后在人和鼠分离出的脑、胰、心、肾、睾丸和肾上腺组织中也被发现。哺乳类动物的NSP是相对分子质量为46×103～55×103的糖蛋白，可以抑制tPA分泌，同时在一定程度上抑制uPA和纤溶酶的活性。脑缺血实验中，脑内tPA 表达上调，增加血管通透性。NSP 也可以一过性上调平衡tPA 的活性[30]。NSP 过表达或颅内给药时，可减低小鼠大脑中动脉闭塞及小鼠脑卒中时的脑损伤。

最新研究显示了NSP 与肿瘤发生发展的联系。Hasumi等发现，NSP在高恶性前列腺癌中表达上调，且NSP 与更短的存活时间相关。然而，NSP 具体如何作用于前列腺癌的发展尚不清楚。胃癌细胞株MKN28 体外转染NSP，可致细胞G1/S 周期阻滞和生长迟缓，该结果显示NSP 可能具有肿瘤抑制作用。胃癌亚群的瘤原性miRNA-21 可引起NSP 的表达下调，使肿瘤增殖增加[31]。进一步研究将阐明NSP 在恶性肿瘤发展中的确切作用机制，并开发其对肿瘤进行干预治疗的潜力。

6 结语

Serpin 具有靶向生物学活性功能，现已证明其对恶性肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移及血管形成均有影响。不同Serpin 的表达与恶性肿瘤的生长具有一定的临床相关性，这些Serpin 可以发展为有效诊断恶性肿瘤和判断恶性肿瘤预后的生物学标记物。Serpin具有抗肿瘤活性，且已经在多种恶性肿瘤模型中得到验证。所以说，不论是单独用药还是辅助治疗，Sepin 具有可观的成为抗肿瘤药物的潜力。尽管迄今尚未报道Serpin 治疗所出现的副作用，但更全面深入的抗肿瘤机制研究可以进一步减少Serpin 治疗所带来的风险。

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