脂质体、免疫刺激复合物和壳聚糖作为黏膜免疫载体的研究现状

王立强 综述，王洪军 审校

沈阳军区联勤部 疾病预防控制中心，辽宁 沈阳 110034

预防控制病毒性传染病的关键技术是研制免疫原性强和免疫途径生物利用率高的有效疫苗。目前，已纳入国家计划免疫的疫苗，除少数为口服外，多数以针剂注射为主，而注射疫苗抗原用量大，针头为潜在的感染源。相比之下，通过鼻黏膜给药更符合原位免疫设计理念，它可以将病毒控制在感染的起始阶段，具有刺激局部黏膜免疫，带动机体系统免疫的优点。气溶胶疫苗抗原对黏膜淋巴组织的刺激是产生分泌性IgG的必要条件，可诱导机体产生早期、高效和持久的免疫应答，形成较长时间的抗病毒状态。因此，鼻黏膜免疫载体和传递系统是气溶胶疫苗鼻腔黏膜免疫策略成功的关键。

1 鼻腔给药特点

鼻腔作为给药部位具有以下生物学特征：①促进药物吸收：鼻腔黏膜上有很多细微绒毛，上皮细胞下有丰富的毛细血管和淋巴管，增加了药物吸收的有效面积，使药物容易通过鼻黏膜吸收；②避免肝脏的首过效应和胃肠道酶的降解：药物经鼻黏膜吸收后直接进入体循环，提高了药物的生物利用度；③给药方便：以滴入或喷入方式给药，患者可自行完成。但鼻黏膜绒毛的另一个生理特点是，任何粉末或颗粒在鼻腔的总接触时间是20～30 min，鼻黏膜上的黏液被纤毛以5～6 mm/min的速度迅速清除[1]。为了解决鼻黏膜免疫的局限性，现已应用近年发展的可降解生物材料脂质体、免疫刺激复合物和壳聚糖等缓释或控释微颗粒来延长疫苗在鼻腔内的滞留时间及滞留量，达到提高有效生物利用度的目的。

2 鼻黏膜免疫

传统的免疫途径为注射给药，机体生理顺应性差，亦有引起返祖现象。鼻腔黏膜免疫是一种非侵入性疫苗接种途径。鼻腔中的酶活性相对较低，可以保护疫苗不受酶的降解。据报道，与口服疫苗相比，抗原经鼻黏膜免疫的剂量为口服免疫剂量的1/4，但仍可在血清及黏液中诱导强有力的抗原特异性抗体反应，鼻黏膜免疫不仅可以诱导产生全身性IgG抗体反应，还可以产生黏膜IgA抗体反应，最终形成两道防御体系来共同保护机体免受传染性疾病病原的侵害[2]。鼻腔中含有丰富的树突状细胞，可以介导强大的全身性及黏膜免疫反应，可以防御各种抗原及病原体通过呼吸系统对机体的侵害。鼻黏膜免疫可在唾液腺及生殖道中产生抗原特异性免疫反应，表明刺激后的淋巴细胞迁移到了共同黏膜免疫系统的特异性效应因子位点，这符合黏膜特异性淋巴细胞归巢的理论[3]。

3 鼻黏膜免疫载体

脂质体（liposome）、免疫刺激复合物（immune stimulating complexes，ISCOM）和壳聚糖（chitosan，CS）是近年发展的黏膜免疫载体。

3.1 脂质体

脂质体是由同心脂质双分子层包围一个水核形成的球形小囊，可以携带脂溶性和水溶性的抗原，主要由磷脂和胆固醇组成[4]。脂质体作为一种新型疫苗载体，具有许多生物学特点：①增强抗原透入细胞的能力，能将目的抗原特异传递到靶细胞中，无毒无免疫原性，减少了疫苗对鼻黏膜的毒性和刺激性[5]；②稳定抗原，防止疫苗抗原被黏膜上的酶类降解而失活，使黏膜免疫部位保持高的疫苗浓度[6]；③包被脂质体的抗原可长期在吞噬细胞和抗原提呈细胞中存在，持续释放被包封疫苗，形成长效缓释作用[7]；④脂质体作为鼻黏膜免疫佐剂具有生物黏附特性，膜表面带负电荷比带正电荷的脂质体有更强的诱导抗体形成的能力，膜表面带有抗原的脂质体载体的作用比膜内带有抗原的脂质体载体更强；特别是带正电荷的脂质体生物黏附性较强，能减少疫苗被黏膜纤毛的清除，使疫苗较长时间保持有效血药浓度，提高生物利用度[8]；⑤可作为鼻黏膜免疫载体，刺激机体的黏膜和全身免疫应答反应；⑥具有生物低密度，可生物降解，易于制备，使用方便。脂质体发挥佐剂作用不受其与抗原连接形式的影响，只须将两者简单混合即可[9-10]。

多种病毒抗原包入脂质体内可以用于鼻腔黏膜接种。此外，将变应原包入脂质体内鼻腔给药，还可抑制特异性IgE抗体反应，从而阻止吸入或食入抗原时引起的变态反应。Childers等[11]首次以人体为对象，研究了鼻内接种脂质体-蛋白菌苗后引起的免疫反应。所用抗原系富含葡萄糖基转移酶的变异链球菌粗制抗原制剂（C-GTF）。受试者鼻内接种包被C-GTF的脂质体后，鼻洗液中特异性抗C-GTF IgA水平有所提高，诱生的唾液特异性IgM和IgA2水平提高程度较低，血清中IgM和IgA水平也有增加。通过进一步比较鼻内接种包被C-GTF的脂质体后诱生的免疫应答与单纯C-GTF诱生的免疫应答，发现脂质体-抗原组中只有鼻洗液特异性IgA1应答显著强于单纯抗原组，提示脂质体可影响局部黏膜免疫应答的强度，而不影响全身应答反应。

脂质体作为气雾疫苗载体，其安全性日益受到关注。小鼠和人体实验结果均表明，脂质体鼻腔给药是安全的。赖氨匹林脂质体家兔鼻腔给药[12]，20 d后处死，显微镜下观察，发现鼻黏膜血管无病理改变，纤毛完好，组织无出血或炎细胞浸润；而给予水溶液的对照组，鼻黏膜血管有轻度损害，纤毛卷曲，有少许炎细胞浸润。脂质体作为载体存在的问题是：①脂质体的尾部脂肪酸易被氧化，影响其稳定性；②小脂质体囊相互融合成大脂质体，易破坏脂质体膜；③批间差异较大。

3.2 免疫刺激复合物

ISCOM是一类以脂质（lipid）、皂素（saponin）为主的复合型佐剂。在ISCOM基质中，皂素分子Quil A结合于固醇类和磷脂酰胆碱，可形成稳定的网状结构，其直径为30～40 nm，能够与抗原疏水部分结合，从而将其亲水面暴露于免疫细胞[13]。

ISCOM是Morein于1984年发现的一种新的疫苗输送系统[14]。其作用机制是，捕获大量抗原分子并释放给抗原提呈细胞，刺激B细胞反应，增加抗体产生，诱导T细胞反应，刺激产生CD4+、CD8+T淋巴细胞和细胞因子IL-12，促进MHC分子的表达，促进CTL活性和细胞免疫[15]。ISCOM也可以促进病毒蛋白的摄取、加工和呈递给特异性CD8+T淋巴细胞，但在鼻腔内上皮细胞不能摄取ISCOM-Matrix投递的抗原，暗示鼻内免疫时，上皮细胞不能被特异性细胞毒性T细胞识别并杀死[16]。其优点是能够快速、有效地将抗原提呈给免疫系统，可在免疫后迅速激活机体的细胞免疫应答和体液免疫应答效果。其复合疫苗与传统疫苗相比，疫苗抗原的需求量减少至1/10～1/2[17]，能够增加抗体反应水平和持久性，也能产生强的细胞介导的免疫反应。而且，复合形成的蛋白抗原性与游离形式的溶液相比稳定性增强。IS⁃COM疫苗的稳定性极好，能被冷冻、冻干，并能溶解于多种缓冲液中，有利于疫苗的保存、贮藏。

ISCOM作为疫苗载体能够发挥免疫佐剂作用：①能够引发MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类CTL反应，平衡Th1和Th2反应，产生包括所有同型和亚型的抗体反应，增强长期的记忆反应[18]，具有免疫调节作用；②诱导IL-2、IFN-γ、IL-12等多种细胞因子，细胞因子之间具有相互激发诱导连锁反应作用[19]；③可以黏附用药，满足黏膜输送系统的要求；鼻腔接种或口服后能引起多种反应，包括远端的肠道、生殖道的黏膜反应；④能更有效地递呈抗原，适于各年龄段人员免疫；⑤ISCOM包含的抗原可以是一种病毒的包膜蛋白、细胞膜蛋白或含疏水区的任何抗原；非疏水性抗原可以加入疏水的尾部，或通过酸处理暴露隐藏的疏水区再整合到ISCOM中[20]，因此能在相对长的时间内起作用。

自1984年Morein等公布ISCOM技术后，这一新的佐剂系统已在多种疫苗中得到应用。马流感病毒和ISCOM整合疫苗已于1989年在瑞典上市，并没有严重副反应。人用疫苗目前仅Flu-ISCOM进入临床试验，其Ⅰ、Ⅱ期临床试验已完成，期待这种新的技术能给传统的疫苗带来变革。将含有ISCOM的疫苗注射接种后，T细胞应答首先在引流淋巴结中被检测到，接种50 d后，在骨髓中也有大量抗体产生细胞[21]，由于抗原提呈细胞的内体小泡和泡质溶胶的双重作用，含ISCOM的疫苗可以通过MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ两种途径将抗原提呈给免疫系统，同时激活CD4+和CD8+T淋巴细胞[22]。含ISCOM的疫苗的另一个优点是可以经口服或鼻腔接种获得免疫，且能达到在局部和全身黏膜表面诱导有效和特异的黏膜免疫应答。小鼠鼻腔接种流感ISCOM疫苗后，可诱导坚强的黏膜抗体和CTL应答反应，并可抵抗攻击感染。气雾ISCOM疫苗除了可以引发MHC-Ⅰ介导的CTL活性外，还有全身性免疫应答，包括特异抗体、分泌型IgA、CD8+T细胞应答等[23]。重复低剂量气雾免疫ISCOM疫苗不会引起免疫耐受[24]。

ISCOM在使用上也存在一些限制性因素。它并非可以和任何抗原都能形成复合体[25]，只有那些含疏水基团很多的抗原或免疫原才能与ISCOM形成复合体，含亲水基团多的抗原（免疫原）不适合与IS⁃COM佐剂混合制备疫苗。

3.3 壳聚糖

壳聚糖是带阳电荷的线性多糖，是一种生物粘性物质，由壳质所产生，存在于甲壳类的壳中，通过脱乙酰作用而形成，可有一系列的脱乙酰程度和不同的相对分子质量。壳聚糖谷氨酸盐的平均相对分子质量约为250×103，脱乙酰程度为80%以上，水溶性（pH6.5），在单一的壳聚糖溶液组方时，其生物利用度可增加5～6倍[26]。壳聚糖又是一种天然聚多糖，有良好的生物相容性和生物可降解性，其分子中的葡糖胺基荷正电，与荷负电的DNA可产生静电作用，凝聚为多聚复合物[27]，这种纳米粒子可以克服疫苗经黏膜吸收的生理学屏障，通过细胞内吞途径，抵达黏膜下淋巴组织，能够与鼻上皮细胞及其黏液层起强烈作用，以保证在被黏膜纤毛清除之前使疫苗通过鼻黏膜[28]。壳聚糖还可以通过上皮细胞之间紧密连接处的暂时开放而增加极性疫苗细胞旁路搬运的能力。实验证明，壳聚糖递送系统可明显增强流感疫苗在小白鼠体内的免疫反应。壳聚糖纳米粒比溶液制剂更有效地促进黏膜对疫苗的吸收，增强机体对疫苗的免疫反应[29]。

壳聚糖是自然界中惟一含游离氨基碱性基团的可食性动物纤维，壳聚糖作为黏膜疫苗载体，具有良好的生物相溶性、低毒性及促渗作用[30]，在鼻黏膜免疫领域倍受关注，它能与活体组织相容，被体内的溶菌酶、胃蛋白酶降解后，降解产物能完全被人体吸收，无毒、无副作用。壳聚糖还具有良好的凝结能力和免疫刺激活性。研究证明，与普通的水溶性流感疫苗相比，含有可溶性壳聚糖的流感疫苗能促进小鼠体内血凝抑制抗体的产生[31]。基于上述生物特性，壳聚糖在黏膜免疫中得到了广泛应用。壳聚糖作为黏膜疫苗载体的作用机制表现如下：①黏膜吸附特性：壳聚糖分子中的羟基、氨基可与黏膜粘液中带负电荷的糖蛋白形成氢键而产生黏附作用，延缓抗原的清除，使其有更多的时间与黏膜接触，使抗原易穿过黏膜屏障，与黏膜下的淋巴组织发生作用；壳聚糖的黏膜吸附性能诱导黏膜和系统免疫反应，与小肠中下游黏膜之间的黏附性，能够加强它与肠腔表面的紧密接触，有利于微球继续向集合淋巴结转运，进而引起全身及黏膜免疫反应[32]；②促渗作用：壳聚糖可使黏膜上皮细胞紧密结合蛋白的结构发生改变，从而开放跨膜通道，提高黏膜通透性，促蛋白抗原大分子的跨黏膜吸收；用壳聚糖及其衍生物作用于细胞单层，可引起跨上皮细胞电阻降低，促进疫苗抗原顺利通过细胞旁路进入体内，增强疫苗的渗透吸收，提高抗原的生物利用度[33]；③壳聚糖在黏膜免疫中的佐剂效应：疫苗经鼻黏膜免疫产生的免疫反应常不能达到理想的免疫效果，故须依赖一些有效的黏膜免疫佐剂和载体系统，而壳聚糖能够提高巨噬细胞、T细胞、浆细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞及多形核细胞的活性和积聚能力，阻止病原微生物的侵入和定居，诱导细胞因子如IFN-γ、IL-4等的产生，激发有效的T细胞免疫应答，中和细菌毒素，增强迟发型变态反应和细胞毒性T细胞反应。壳聚糖自身还可引起IL-10释放及黏膜IL-4的表达，并激活脾脏的CD4+T细胞，明显上调黏膜Th2免疫反应，巨噬细胞摄取壳聚糖后即可活化[34]。壳聚糖的这种非特异免疫佐剂作用与其脱乙酰化程度和剂型有关，脱乙酰化程度高的可溶性壳聚糖活性较弱，而颗粒状壳聚糖更易诱导巨噬细胞的吞噬作用[35]。壳聚糖可有效促进局部（特别是黏膜局部）的免疫反应，增强抗原传递系统功能，具有免疫佐剂和免疫调节效应。

4 结语

综上所述，脂质体、免疫刺激复合物和壳聚糖作为新型鼻黏膜免疫载体或佐剂，为鼻腔黏膜途径给药开拓了更为广阔的应用前景。目前脂质体尚存在不够稳定等缺点，给长期贮存及用药带来不便。应结合鼻腔黏膜的生理结构特点来综合考虑脂质体的粒径大小、表面电荷和制备方法等因素，以达到最佳应用效果。免疫刺激复合物佐剂是适合所有疫苗的通用免疫调解技术平台，它能够刺激机体对常规疫苗用量1/10的抗原产生相同或更强的抗体和细胞免疫反应，而且这种反应持续时间长，未见过敏反应或其他严重毒害事件发生的报道。以ISCOM为载体的抗宫颈癌疫苗和高效低毒流感疫苗已进行Ⅰ、Ⅱ期临床试验，市场潜力巨大。壳聚糖是天然来源的多糖类阳离子高分子材料，来源广泛，纳米微粒、微球制备工艺简单，不需有机溶剂，有利于疫苗的稳定。目前水溶性壳聚糖品种不多，一般需要溶解于醋酸等弱酸溶液中，由于pH值较低，DNA疫苗容易在制备过程中降解，因而开发和采用水溶性好的壳聚糖衍生物是十分必要的。随着研究的深入和新剂型的开发，壳聚糖纳米载体和PEG交联壳聚糖季铵盐水凝胶作为佐剂和载体，将会在黏膜免疫产业化进程中发挥重要作用[25]。因此，新型鼻黏膜疫苗的开发，主要通过鼻黏膜表面抗原呈递系统的改进来实现。国外科学家已将痘病毒气雾疫苗成功地应用于猴体试验，安全有效，艾滋病和人乳头状瘤病毒气雾疫苗、麻疹气雾疫苗已经世界卫生组织批准进入了临床试验。

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