透明质酸生产中生物发酵工艺过程

姜晖

（恩宜珐玛（天津）工程有限公司上海分公司，上海 200052）

透明质酸的生产工艺是典型的生物发酵及提取过程。其中，生物发酵复杂多变，并且直接影响到产品的产量和质量，对于生产过程至关重要，本文将对其着重介绍。

1 透明质酸

透明质酸（bHA）具有良好的保湿作用，其多用于制药及化妆品，它的特点是保湿性受周围环境的相对湿度影响较小。透明质酸在相对湿度较低时(33%)吸湿量相对最高，在相对湿度较高时(75%)吸湿量相对最低。这种独特的性质适合不同季节、不同环境湿度(如干燥的冬季和潮湿的夏季)皮肤对化妆品保湿作用的要求。

透明质酸分子中含有大量的羧基和羟基，在水；溶液中形成分子内和分子间的氢键，这使其具有强大的保水作用，可结合自身400倍以上的水；在较高浓度时，由于其分子间作用形成的复杂的三级网状结构，其水溶液又具有显著的粘弹性。透明质酸作为细胞间基质的主要成分，直接参与细胞内外电解质交流的调控，发挥物理和分子信息的过滤器作用。大分子透明质酸对细胞移动、增殖、分化及吞噬功能有抑制作用，小分子透明质酸则有促进作用。

透明质酸可用作眼科人工晶体植入手术的粘弹剂、骨性关节炎和类风湿性关节炎等关节手术的填充剂，作为媒介在滴眼液中广泛应用，还用于预防术后粘连和促进皮肤伤口的愈合。与其它药物反应形成的化合物对药物发挥缓释作用，可达到定向和定时释放的目的。随着医药科技的发展，透明质酸在医药方面的应用将越来越广泛。

2 透明质酸生产中的生物发酵

透明质酸生产中生物发酵简单的工艺流程见图1:

图1

2.1 混料

混料罐用于进行原材料的预混，预混好的料将用于种子发酵工序或者主发酵工序。混料罐是手动操作，原材料和溶液在混料罐中通过搅拌混匀以后通过泵转移至下一级罐，而混料罐的在线清洗是通过在线清洗站自动控制来完成。混料罐的容积大小需根据产品产量来决定，混料的时间通常小于1h。

具体操作流程为：

1）将料斗安装在罐口，另一端接到排风系统以防止粉尘散落到房间中。2）打开手动操作阀门通过观察称重传感器加入一定量的纯水在混料罐中。3）将装有原材料的袋子通过叫料斗倒入混料罐。4）pH值按工艺需要调节到4～10。5）当原材料完全被倒入罐底以后，将搅拌器调整至高速。6）通过传输泵将混合好后的溶液转移至种子发酵罐。7）混料罐溶液转移完成以后需要通过在线清洗站做在线清洗，此时搅拌器转速需要跳到低速，在线清洗可以将罐中残留清洗干净，以免对下一个批次产生污染及影响。

2.2 给料

给料罐用于准备蔗糖溶液，而后蔗糖溶液被转移至种子发酵罐或者主发酵罐。通常给料罐包含两个给料罐和一条转移管道，目的是为了操作可以在循环模式下进行，以确保每一个罐都能通过一个循环。当一个罐里的蔗糖溶液用完以后，将会从转移管道断开，进行清洗、灭菌，再加入新的培养基溶液再次连接到转移管道，从而形成一个循环。所有的操作均为手动操作，只有在线清洗为自动操作。

具体操作流程为：

1）通过手动阀门从转移管道断开给料罐，连接两个给料罐通过特殊的截断阀门，以保证不出现交叉污染。2）通过在线清洗站做在线清洗，此时搅拌器转速需要跳到低速。在线清洗是为了确保罐里没有上一批次溶液的残留和污染。3）培养基准备：安装手动料斗在罐口，另一端接到排风系统以防止粉尘散落到房间中。4）打开手动操作阀门通过观察称重传感器加入一定量的纯水在给料罐中。5）将装有蔗糖的袋子通过叫料斗全部倒入给料罐中。6）给料罐通过蒸气进行加热。7）当蔗糖完全被倾倒入罐底以后，搅拌器需要调整至高速。8）关闭罐口，使给料罐可以进行灭菌。9）给料罐自动被洁净蒸汽加热到95℃，为了降低振动需要在洁净蒸汽中混入一些空气。10）继续再加热到灭菌温度。11）保持在灭菌温度下设定的灭菌时间。12）灭菌完成后由操作人员打开冷却水，进行冷却。13）冷却到需求温度后转移至下一级发酵罐。

2.3 细胞培养

培养箱用于最初的细胞培养，是一个单独的设备。细胞在锥形瓶中的培养基里面增长并且在恒温恒湿的环境下，培养箱通过控制温度达到细胞培养的最佳环境。因此培养箱内部温度的恒定性验证需要通过验证仪来校验合格。

2.4 种子发酵

种子发酵罐用于生物转换糖和营养物质进入到产品中而进行生物发酵。营养液在种子发酵罐中进行灭菌，然后加入预灭菌的蔗糖溶液，在发酵罐被洁净蒸汽冷凝水充满之前，接种物质开始接种到种子发酵罐当中。种子发酵完成后形成的种子液体培养基将会转移至相应的主发酵罐中进行进一步的发酵。

具体操作流程为：

1）培养基转移。2）称量电极已校验，阀门已连接好。3）将混料罐和主发酵罐通过软管连接好，将混料罐中的溶液转移至主发酵罐当中达到规定的液位值。4）搅拌器调至一定转速。5）确保储罐，阀门达到可以灭菌状态包括冷却夹套和盘管的放净。6）灭菌：过程分为三个阶段：加热排除空气；加热到95℃排除空气；继续加热到121～125℃，保持灭菌一定时间。整个过程通过PLC来控制。7）冷却：关闭蒸汽开启洁净空气避免发酵罐压力过大。8）压力保持一定冷却到控制的发酵温度。9）消毒后pH值调整：消毒后通过加入磷酸来调整pH值4～9。10）接种之前加入维生素和NaOH。11）从给料罐中加入一定量的蔗糖溶液。12）接种：将接种物质从罐口加入。13）发酵：保持合适的温度20～45℃，搅拌速度，压力0～1bar和空气流量。14）接种转移：通过输送管道转移至主发酵罐。15）在线清洗：接种液传输完毕，进行在线清洗，以防止交叉污染。

2.5 主发酵过程

主发酵过程与种子发酵过程相似。主发酵罐用于生物转换糖和营养物质进入到产品中进行生物发酵。营养液在主发酵罐中进行灭菌，然后加入预灭菌的蔗糖溶液，在发酵罐被洁净蒸汽冷凝水充满之前，接种物质开始接种到主发酵罐当中。主发酵完成后形成的溶液转移至下一步提取过程中。

具体操作流程为：

1）培养基转移。2）称量电极已校验，阀门已连接好。3）将混料罐和主发酵罐通过软管连接好，将混料罐中的溶液转移至主发酵罐当中达到规定的液位值。4）搅拌器调至一定转速。5）确保储罐，阀门达到可以灭菌状态包括冷却夹套和盘管的放净。6）灭菌，过程分为三个阶段：加热排除空气；加热到95℃排除空气；继续加热到121～125℃，保持灭菌一定时间。整个过程通过PLC来控制。7）冷却：关闭蒸汽开启洁净空气避免发酵罐压力过大。8）压力保持一定冷却到控制的发酵温度。9）消毒后pH值调整：消毒后通过加入磷酸来调整pH值4～9。10）接种之前加入维生素和NaOH。11）从给料罐中加入一定量的蔗糖溶液。12）接种：对种子罐到主发酵罐的传输管道灭菌。13）溶液从种子发酵罐转移至主发酵罐。14）发酵：pH值通过NH3或者H3PO4控制。15）蔗糖的加入通过溶解氧来控制适宜的流量。16）泡沫监测器监测到泡沫需要手动加入止泡剂。17）保持合适的温度20～45℃，搅拌速度，压力0～1bar和空气流量。18）收获：收获过程中主发酵罐通过洁净空气保持一定的压力。19）将主发酵罐连接到下游提取相应的设备。20）在线清洗：接种液传输完毕，进行在线清洗，以防止交叉污染；在线清洗站自动完成主发酵罐的在线清洗。

3 结语

经过上述发酵过程，所得发酵液经过过滤、提取、干燥即可得到透明质酸粉末状成品。整个工艺过程稳定可控，可根据具体产量要求放大或缩小生产规模。