白藜芦醇对淋巴瘤BJAB细胞体外增殖及细胞周期作用的研究

何广辉，孙丰源

（1.天津市眼科医院玻璃体视网膜中心，天津医科大学眼科临床学院，天津300040；2.天津市第一中心医院眼科，天津 300192）

白藜芦醇(resveratrol，Res)于1940年首次从毛叶藜芦的根部提取获得，它广泛存在于虎杖、葡萄等21个科、31个属的72种植物中[1]，是一种天然活性成份。从19世纪70年代至今，大量科学实验证实白藜芦醇具有抗肿瘤活性，对肿瘤的起始、促进、发展3个主要阶段均有抑制作用[2-4]。本实验选取B淋巴细胞来源的BJAB细胞作为实验对象，应用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）比较不同作用浓度及作用时间的Res对BJAB细胞增殖的影响，并应用流式细胞术（Flow cytometry，FCM）分析Res对BJAB细胞周期的影响，为其作为抗B细胞淋巴瘤药物的应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料 BJAB细胞由天津医科大学免疫学教研室杨洁教授惠赠。Res由南开大学医学院惠赠。MTT、青霉素、链霉素、碘化丙啶购自Sigma公司。RPMI-1640干粉、PBS干粉、二甲基亚砜购自GIBCO公司。

实验仪器：CO2培养箱（SANYO），倒置相差显微镜（NIKON），超净工作台（苏州净化设备公司）,Milli-Q超纯水系统，恒温烤箱（格兰仕），酶标测定仪（BIO-RAD），台式低速离心机（北京医用离心机厂），低温冰箱（SANYO），低温高速离心机（HITACHI），分析天平（BOSCH），24孔及 96孔培养板（Cellstar），细胞培养瓶（GLOSTAR），流式细胞仪（COWTER）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及给药 实验分为空白对照组和实验组。空白对照组加入不含Res、无血清的RPMI-1640培养液；实验组分为6组，分别加入含终浓度为5、10、25、50、75、100μg/mL的Res，每组设6个复孔。

1.2.2 MTT法检测Res对BJAB细胞增殖的影响

BJAB细胞以103/孔接种于96孔板中，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液200μL培养48h,然后换为无血清无双抗的培养液200μL继续培养24 h，实验组分别加入含不同浓度Res的培养液200μL，空白组加无血清的培养液200μL，分别作用24、48、72 h，观察细胞形态的变化。实验及空白组常温低速离心（800 r/min）5min后吸出上清液100μL，然后加入20μLMTT液，37℃,5%CO2培养箱继续孵育4 h后，加入150μLDMSO，室温下于微量振荡器上振荡5min，于570 nm测定各孔OD值。计算不同浓度药物对细胞的抑制率（IR）。IR%=（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值×100%[7]。

1.2.3 FCM检测Res对BJAB细胞周期的影响

细胞培养及加药过程同前，分别收集实验组25、50、100μg/mLRes作用 24 h和 50μg/mLRes作用24、48、72 h的BJAB细胞以及对照组BJAB细胞，每份加冷PBS洗涤离心2次，然后加预冷的70%乙醇4℃固定过夜。次日弃去乙醇后，PBS洗涤离心，弃去上清液，每份样本加0.2mLPBS，将细胞轻轻吹打成单细胞悬液，加入0.5mLPI染液，40℃避光染色30min，488 nm检测荧光强度，计算各时相细胞比例及增殖指数[PI=（S＋G2）/（G1＋S＋G2）][8-9]。

1.3 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件，所有数据用x±s表示，经正态分布和方差齐性检验，进行组间单因素方差分析。样本率之间的统计分析用χ2检验。

2 结果

2.1 形态学改变 不同浓度药物作用后，实验组与对照组相比，细胞密度有所下降，细胞形态发生变化，部分细胞体积缩小，呈小圆形，部分细胞呈梭形，核仁不清晰，胞质不匀，随着浓度的增加，细胞数目减少，并且多数细胞呈梭形。随着药物作用时间延长，实验组细胞密度降低，细胞不同程度呈现出核固缩、核碎裂、核溶解等凋亡特征（图1～3）。

图1 25μg/m L Res作用24 h后BJAB细胞形态学改变（×200）Fig 1 M orphology changeof BJAB cellaffe cted by 25 μg/m L Res for 24 h（×200）

图2 50μg/m L Res作用24 h后BJAB细胞形态学改变(×200）Fig 2 M orphology changeof BJAB cell affected by 50μg/m L Res for 24 h

图3 50μg/m L Res作用48 h后BJAB细胞形态学改变（×200）Fig 3 M orphology changeof BJAB cell affected by 50μg/m L Res for 48 h

2.2 MTT法测定Res对BJAB细胞的抑制作用见表1。

表1 不同浓度药物组作用不同时间后的OD值（x±s，n=6）Tab1 OD value of different durations and densities of Res on BJAB（x±s，n=6）

不同浓度的Res作用于BJAB细胞24、48、72 h，均可不同程度地抑制细胞的增殖。其中5μg/mLRes与对照组比较，在24 h作用不明显，而其余各浓度组在各时间点与对照组比较，对细胞都有明显的抑制作用（P<0.05或P<0.01）。结果可见，Res对BJAB细胞的抑制作用呈时间依赖性和剂量依赖性（图4）

图4 不同浓度Res对BJAB作用不同时间的抑制率Fig 4 Inhibition ratio of different durationsand densitiesof Reseffected on BJAB

2.3 流式细胞仪检测Res对BJAB细胞周期的影响 以浓度为 0、25、50、100μg/mL处理细胞 24 h后，用流式细胞仪检测BJAB细胞周期，结果见表2。可见随着Res浓度增大，G1期细胞百分数增多，而S、G2期的细胞数量逐渐减少，计算增殖指数可见，随着用药浓度增大而BJAB细胞增殖指数呈下降趋势（P＜0.05）。

表2 不同浓度Res作用24 h对BJAB细胞周期的影响Tab2 Influence of cell cycle of BJAB which affected by different densitiesof Res for 24 h

用 50μg/mL Res分别处理 BJAB细胞 0、24、48、72 h，流式细胞仪检测结果显示随着Res作用时间延长，G1期细胞百分数增多，而S、G2期的细胞百分比逐渐减少（表3）。

表3 50μg/m L Res在不同作用时间对BJAB细胞周期的影响Tab3 Influence of cell cycle of BJAB which affected by different durationsof 50μg/m L Res

3 讨论

Res化学名 3，5，4-三羟基芪 (3，5，4-trihydroxystilbene），是一种植物防御素（phytoalexin），具有广泛的生物学活性，如抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗凝血、抗氧化、抗菌、免疫调节及神经保护等[10-11]。近年来研究发现Res在抗肿瘤方面具有较好的效果，其抗肿瘤作用机制主要体现在以下各方面：（1）防止正常细胞癌变[12-13]：抑制细胞色素P450 1A1（CYP 1 A1）；抑制环氧酶(COX)；抗氧化损伤。（2）抑制肿瘤细胞增殖[14-15]：抑制DNA复制过程的关键酶；拮抗雌激素；改变自分泌生长调节因子；抑制肿瘤细胞自分泌活性氧。（3）促进肿瘤细胞凋亡[16-17]：作用于细胞周期蛋白及细胞周期蛋白依赖性激酶而致凋亡；通过p53引发凋亡；影响bcl-2家族诱导凋亡；通过线粒体介导凋亡。本实验研究发现，高浓度及长时间Res作用可使BJAB细胞形态发生改变，胞体变为梭形，两极尖细，胞质浑浊，核固缩，甚至消失，胞间增宽，细胞碎片增多。5μg/mLRes在短时间内对BJAB细胞增殖抑制作用不明显，当时间延长至48 h，可显著抑制BJAB细胞的增殖（P<0.05），而25、50、75、100μg/mL 组在各时间点与对照组比较，对细胞都有明显地抑制作用（P<0.01）。同一浓度的药物随着作用时间的延长，抑制作用逐渐加强，表明Res对BJAB细胞的抑制作用呈时间依赖性。而同一时间内，随着药物浓度的增加，抑制作用也增强，表明Res对细胞增殖的抑制作用具有剂量依赖性。

Jazirehi等[18]认为，Res可以抑制非霍奇金淋巴瘤以及多发性骨髓瘤细胞的增生，并促进其凋亡，原因在于Res可以使肿瘤细胞的细胞周期停留在G1期，此外，Res还可以选择性地下调抗凋亡蛋白Bcl-xL和骨髓细胞分化因子1（Mcl-1），并可以上调凋亡前体蛋白Bax和凋亡蛋白酶激活因子Apaf-1。本实验研究发现用不同浓度的Res处理细胞24 h后，用FCM检测BJAB细胞周期，可发现随着Res浓度增大BJAB细胞G1期细胞百分数增多，而S、G2期的细胞逐渐减少，并且随着用药浓度增大而BJAB细胞增殖指数呈下降趋势。用50μg/mLRes分别处理BJAB细胞0、24、48、72 h，流式细胞仪检测结果显示随着Res作用时间延长BJAB细胞G1期细胞百分数增多，而S、G2期细胞逐渐减少。

Res对BJAB细胞的作用可能涉及多种机制，本实验证实Res直接抑制BJAB细胞增殖，并导致其产生细胞周期的改变。本实验仅在细胞水平上观察了Res对BJAB细胞的作用，有待进一步在分子及蛋白质水平研究其作用机制，并且需要进行动物实验来证实Res针对淋巴瘤动物模型治疗的有效性和安全性，将这一相对经济、有效、低副作用的植物活性成分应用于淋巴瘤患者的临床治疗。

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