Folin—Ciocalteu法测定昭通葡萄及其葡萄酒总酚含量

袁晓春 李辅碧

摘要 [目的] Folin-Ciocalteu法测定葡萄总酚含量，为昭通葡萄生产及其酿制工艺提供科学依据。[方法] 采用甲醇作溶剂，超声提取葡萄总酚，以Folin-Ciocalteu试剂和50 g/L Na2CO3溶液处理，在765 nm处测其吸光度。 [结果] 以没食子酸为标准，质量浓度在1～40 mg/L范围内与吸光度线性关系良好（r=0.999 5）。平行测定（n=6）葡萄总酚含量，RSD在1.1%～1.6%，对葡萄和葡萄酒的加标回收率试验结果分别为98.8%、98.3%，RSD依次为1.8%、2.0%。 [结论] 该法操作简便，重复性好，结果准确可靠，可用于测定葡萄及葡萄酒中总酚含量。

关键词 昭通葡萄;Folin-Ciocalteu法;测定;总酚

中图分类号 S663.1 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2014）33-11859-02

Measure of Total Polyphenols Content in Zhaotong Grape and Grape Wine by Folin-Ciocalteu Method

YUAN Xiao-chun1， LI Fu-bi2 （1. Zhaotong University， Zhaotong，Yunnan 657000; 2. Food and Drug Inspection Office in Zhaotong City， Zhaotong， Yunnan 657000）

Abstract [Objective] In order to provide scientific basis for production and brewing of Vitis vinifera in Zhaotong， the total polyphenol content in grapes was measured by Folin-Ciocalteu method. [Method] Using methyl alcohol as the solvent， total polyphenols of Vitis vinifera was extracted by supersonic method， then added Folin-Ciocalteu reagent and 50 g/L Na2CO3 solution， and measured the absorbancy at 765 nm. [Result] Basing on gallic acid， the mass concentration had an obvious linear relation （r=0.999 5） with absorbancy within the scope of 1-40 mg/L. The parallel determination （n=6） of total polyphenol results were that， when RSD was between 1.1% to 1.6%， the adding standard recovery of Vitis vinifera and grapes wine were 98.8%， 98.3%， RSD 1.8%， 2.0%. [Conclusion] This method is convenient， repeatable and faithful， which can be used for determination of polyphenol in grapes and grape wine.

Key words Zhaotong grape; Folin-Ciocalteu assay; Determination; Total polyphenol

作者簡介 袁晓春（1968- ），女，云南威信人，讲师，从事物质成分分析及其应用的研究。

收稿日期 2014-10-17

植物多酚（Plant polyphenol）又名植物单宁（Vegetable tannin），为植物体内的复杂酚类次生代谢物，具有多元酚结构，主要存在于植物的皮、根、叶、果中。植物多酚具有很强的抗氧化和清除自由基活性，水果、蔬菜、饮料等是植物多酚的主要来源[1]。因为果实汁多味美并含有丰富营养，而倍受人们青睐的葡萄[2]中就含有大量的多酚类物质。葡萄多酚是一种植物多酚类活性物质，能溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，它广泛存在于葡萄籽、葡萄皮与果汁中。葡萄多酚由表儿茶酸等酚酸类、黄烷醇类、花色苷类、黄酮醇类和缩聚单宁等物质组成[3]。研究表明，葡萄中的多酚含量对葡萄酒的酿制影响很大。葡萄酒存放时多酚的各种化学反应将影响到葡萄酒的色泽、口感、品质。在葡萄酒酿制和葡萄多酚提取中，都要对多酚含量进行监控和测定。采用Folin-Ciocalteu法测定葡萄多酚具有很好的精密度和准确度[4]。

葡萄和葡萄酒中所含多酚可以消除人体内的自由基而起到抗氧化、抗肿瘤、抗癌、降血脂、预防动脉粥样硬化和冠心病等保健作用，因而深受人们喜爱。生活在云南昭通的人们除了喜欢食用新鲜葡萄，好多家庭还在本土葡萄大量上市的时候，选择新鲜葡萄自行酿制葡萄酒[5]。为此，笔者对昭通葡萄及其家酿葡萄酒进行采样，通过超声提取技术，采用Folin-Ciocalteu法测定其葡萄总酚量，以期为昭通葡萄的生产及其葡萄酒的酿制工艺提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原材料。从市场购进昭通本土出产的不同品种的新鲜葡萄，在不同家庭采集以昭通葡萄为原料的家酿葡萄酒。

1.1.2 主要试剂。

Folin-Ciocalteu试剂，上海荔达生物科技有限公司（分析纯 20140806）;无水碳酸钠，分析纯，天津化学试剂三厂;甲醇，色谱纯Fisher Scientific公司;没食子酸标准品，中国食品药品检定研究院，110831-201204;水，超纯水。

1.1.3 主要仪器。GZX-9246MBE数显鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备;MS105DU电子天平，梅特勒-托利多公司; UC-7100S超声波清洗器，美瑞泰克科技（天津）有限公司;TG16-WS台式高速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司; UV-2550紫外可见分光光度计，日本岛津公司。

1.2 方法

1.2.1 试剂的配制。

50.0 mg/L标准溶液：准确称取5.0 mg没食子酸标准品溶解于8.0 ml的甲醇中，并用超纯水定容至100 ml（现配）。50 g/L Na2CO3溶液：称取50.00 g无水Na2CO3，溶于超纯水并定容至1 000 ml。80%甲醇溶液：量取80 ml 甲醇，加12 mol/L的盐酸0.1 ml ，并用超纯水稀释定容至100 ml[6]。

1.2.2 试样的准备。将2种新鲜葡萄的葡萄皮1号、2号，于40 ℃下烘80 min后冷却备用。采集3个家庭以昭通葡萄为原料的家酿葡萄酒3号、4号、5号（酿制年份、保存条件不详）。

1.2.3 显色时间的确定。准确吸取50.0 mg/L没食子酸标准溶液0.50 ml于25 ml比色管中，加入80%甲醇溶液0.50 ml、1.00 ml Folin-Ciocalteu试剂、50 g/L Na2CO3溶液8.00 ml，充分摇匀，在15、30、45、60 min处测其吸光度，在15～45 min的吸光度逐渐增大，45 min后吸光度有所降低。以此确定测定反应的显色时间为45 min。

1.2.4 总酚的提取。准确称取0.050 g已烘干的葡萄皮，置于5.0 ml 80% 甲醇溶液中，在40 ℃、40 kHz超声提取40 min后，在4 000 r/min下离心20 min后分离出上层清液，同等条件下提取2次，合并提取液，用超纯水稀释并定容至100 ml。

对于家酿葡萄酒，直接吸取1.0 ml于100 ml容量瓶中，加8.0 ml 甲醇并用超纯水定容。

2 结果与分析

2.1 工作曲线的绘制

准确吸取50.0 mg/L没食子酸标准溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80 ml分别于7支25 ml比色管中，依次加入80%甲醇溶液1.00、0.90、0.80、0.70、0.60、0.40、0.20 ml。測样品时，吸取试液1.00 ml。然后加入1.00 ml Folin-Ciocalteu试剂，充分振荡后，依次加入50 g/L Na2CO3溶液溶液8.00 ml，充分摇匀，45 min后，于25 ℃下，在765 nm处测其吸光度，以吸光度对没食子酸标准溶液的质量浓度作图，酚含量在1～40 mg/L范围内与吸光度呈良好的线性关系，线性计算公式y=0.015 9x-0.002 5，r=0.999 5。

2.2 总酚量测定结果

按照“2.1”分析步骤，对葡萄皮试液1号、2号和家酿葡萄酒3号、4号、5号试液各进行6次平行测定，葡萄皮总酚含量计算公式：葡萄皮总酚含量（mg/g）=xVn/ms，其中x=（y+0.002 5）/0.015 9（mg/L），V=0.001 L，n=100（稀释倍数），ms为葡萄皮试样的质量;葡萄酒总酚含量计算公式：葡萄酒总酚含量（mg/L）=nx，x=（y+0.002 5）/0.015 9（mg/L），n=100（稀释倍数）[7]。葡萄皮和家酿葡萄酒总酚含量测定结果见表1和表2。

由表1、2可见，平行测定样品总酚含量的RSD在1.1%～1.6%，说明该方法具有较好的精密度。

表1 葡萄皮总酚量测定结果

表2 家酿葡萄酒总酚量测定结果

2.3 回收率试验结果

利用“2.2”节的分析结果，分别按1号葡萄皮试液总酚含量的63.3%、94.9%、126.6%和3号家酿葡萄酒试液总酚含量的65.8%、98.7%、131.6%，添加50.0 mg/L没食子酸标准溶液，各平行试验3次，测定其总酚含量，并计算回收率。试验结果见表3，可见该方法具有较好的回收效果。

表3 回收率试验结果

3 结论与讨论

以Folin-Ciocalteu 法测定昭通葡萄及其家酿葡萄酒的总酚含量。选用50.0 mg/L没食子酸溶液为标准，其质量浓度在1～40 mg/L范围内与吸光度呈良好的线性关系（y=0.015 9x-0.002 5，r=0.999 5）。准确称取40 ℃下烘干葡萄皮0.050 g，采用80%甲醇溶液作为溶剂，在40 ℃、40 kHz超声提取昭通葡萄皮总酚。移取1.00 ml试液，以1.00 ml Folin-Ciocalteu试剂和8.00 ml 50 g/L Na2CO3溶液处理，显色45 min后，在765 nm处测定葡萄皮和家酿葡萄酒试液的吸光度。平行测定（n=6）总酚含量RSD在1.1%～1.6%。对葡萄皮和葡萄酒试液进行加标回收率试验的平均回收率分别为98.8%、98.3%，RSD分别为1.8%、2.0%。该法操作简便，具有较好的精密度，重复性好。

2种品种的市售昭通葡萄总酚含量有一定的差别，可能是因为购进的葡萄品种不一样，再加上葡萄的种植方式和生长周期可能也不相同等因素所致。昭通葡萄总酚含量的高低具体受哪些因素影响及其如何影响的问题，还待进一步研究。3种家庭酿制的葡萄酒总酚含量差别较大，可能是因为各个家庭酿制葡萄酒时选用了不同品种的昭通葡萄、采用了

不同酿制工艺、在不同环境下以不同的方式保存葡萄酒和保存家酿葡萄酒的时间长短不一等因素所致[8]。

参考文献

[1]李文仙，俞丹，林玲，等.Folin-Ciocalteu比色法应用于蔬菜和水果总多酚含量测定的研究[J].营养学报，2011，33（3）：302-307.

[2] 杨勇，杨俊祥，宫霞，等.葡萄及葡萄属植物中的天然活性物质研究与利用现状[J].酿酒科技，2011，204（6）：75-79.

[3] 左丽丽，王振宇，樊梓鸾，等.植物多酚类物质及其功能研究进展[J].中国林副特产，2012，120（5）：39-43.

[4] 李静，聂继云，王孝娣，等.Folin-Ciocalteus法测定葡萄和葡萄酒中的总多酚[J].中国南方果树，2007，36（6）：86-87.

[5] 徐国前，张振文，郭安鹊，等.微量、快速测定葡萄与葡萄酒总酚[J].食品科学，2010，31（18）：268-270.

[6] 蔡文国，吴卫，邵金凤，等.Folin-Ciocalteu法测定鱼腥草多酚的含量[J].食品科学，2010，31（14）：201-204.

[7] 李春阳，许时婴，王璋.从葡萄废弃物中提取分离多酚类生物活性物质[J].食品科技，2004，152（6）： 88-93.

[8] 于贞，赵光鳌，李记明.葡萄皮中的酚类物质对葡萄酒中酚含量的影响[J].酿酒科技，2010，190（4）：46-47.