UA-SPE-HPLC快速分离法测定乳饮料中的硫氰酸钠的研究

张丽媛，姚笛，贾鹏宇，王颖，李秀波

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆163319；2.黑龙江省农产品加工工程研究中心）

牛乳及其制品以其营养价值高，富含钙、维生素D等营养成分而受到大众的欢迎，但也因此成为掺假、制假的温床。据报道，健康牛奶中平均含有0.9 mg·kg-1的硫氰酸离子，是乳制品过氧化物酶抗菌体系的主要成分之一。含乳饮料是以鲜乳或乳制品为原料，经发酵或未经发酵加工制成的制品，含乳饮料中掺入硫氰酸钠后可有效的抑菌、保鲜，但硫氰酸钠能在体内释放氰根离子，并很快与细胞色素氧化酶中的三价铁离子结合，抑制该酶的活性，使组织不能利用氧而导致人昏迷[1]。另有报道称，由于硫氰酸钠在人体内代谢可形成硫氰酸，可干扰人的甲状腺功能，导致非缺碘性甲状腺肿，影响人体正常生理代谢[2]。

目前，国内外关于硫氰酸盐的研究多集中在化学和生物方面，如运用硫氰酸盐离子吸附形成复杂的离子交换剂[3]、硫氰酸钠对银腐蚀溶出度氨基硫脲解率的影响[4]等。在硫氰酸钠检测方法方面主要有毛细管电泳法[5]、离子色谱法[6]、分光光度法[7]、气相色谱法[8]、电化学法[9]。张永峰[10-11]等建立了离子色谱/电导检测分析奶粉、牛奶中硫氰酸盐的方法，针对不同形态的乳制品前处理方法进行重点研究和讨论。宋洁[12]等利用顶空进样-气相色谱法检测乳制品中硫氰酸盐的含量，采用蒸馏水提取乳制品中的硫氰酸盐，用乙酸锌沉淀乳制品中的蛋白质，将硫氰酸离子衍生后，采用顶空进样，气相色谱法检测。

主要研究了乳饮料中硫氰酸钠的前处理方法，利用乙腈加酸溶液沉淀蛋白，超声辅助萃取乳饮料中的硫氰酸钠，固相萃取柱进行净化，高效液相色谱法[13]进行检测，并对超声时间、萃取条件等进行讨论和研究。

1 材料和方法

1.1 试剂

三氯乙酸、硫氰酸钠、丙酮、乙醚、乙酸乙酯，以上均为分析纯；甲醇、乙腈为色谱纯。

硫氰酸盐标准储备液：称取在80℃下烘2 h的硫氰酸钠0.083 17 g于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，即得浓度为500μg·mL-1的硫氰酸盐标准储备液。

硫氰酸钠标准溶液：将硫酸氰钠标准储备液（500μg·mL-1） 逐级稀释得到浓度为0.020、0.10、0.50、2.50、12.50、20.00 mg·mL-1的标准溶液。

0.02 moL·L-1磷酸盐缓冲溶液：称取含两个结晶水的磷酸二氢钠0.312 g，加水溶解并定容至100mL，加磷酸调节pH=4.0，经0.22μm微孔滤膜（水相）过滤后备用。

1.2 仪器设备

高效液相色谱仪（PC-2025型，美国SSI有限公司），配紫外检测器；超声波仪（上海生析超声波仪器有限公司）；分析天平（Mettler AE240，瑞士）；高速离心机（安徽中科中佳仪器有限公司）；一次性水系（纤维素）、有机系（尼龙）针式滤膜（0.22μm，天津市兰博仪器公司）。

1.3 加标样品

乳饮料：乳饮料样品共5种，复原乳样品、爽歪歪，AD钙奶和味动力及优酸乳分别设为样品1、2、3、4、5，均购买自超市。在2.2.2中的样品分别是样品1、2、3、4、5，其他所有结果都是由样品1获得。在乳饮料样品中加入硫氰酸钠标准溶液并振摇2 min获得加标样品溶液。

1.4 萃取过程

准确称取5 g试样于50 mL离心管中，加入5.0μg·mL-1标准溶液20μL，振摇混均后向其加入少量去离子水、2mL 0.1moL·L-1三氯乙酸和30 mL乙腈，最后用去离子水定容，超声提取10 min，14 000 r·min-1离心5 min，静置，取上清液滤入10 mL离心管中，氮气吹干，用去离子水定容。过经2mL甲醇、2 mL水活化后的C18固相萃取小柱，收集流出液，过0.22μm有机滤膜待测。在50mL离心管中，不加入乳饮料，其他按照上述过程依次处理，过膜后得到空白样品溶液待测。

1.5 硫氰酸钠的HPLC测定

色谱条件：色谱柱：XDB C18柱（5 mm，4.6 mm×150 mm）；C18（4.0 mm×50 mm） 保护柱。流动相：0.02 moL·L磷酸盐缓冲溶液-乙腈（50∶50）；流速：0.5 mL·min-1；柱温：35℃；检测波长：218 nm；定量环体积：20μL。

将空白样品溶液、标准溶液、加标样品溶液和样品溶液依次按照上述色谱条件进行HPLC分析，得到色谱图以及峰面积。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法的确定

样品前处理的基本原则是：首先用去离子水对目标物进行提取，再采用有机溶剂沉淀蛋白质，进而用固相萃取小柱净化、去除脂肪等有机物，得到测试液。鉴于硫氰酸钠无机盐的属性以及定量计算方便，选择三氯乙酸加有机溶剂沉淀蛋白—超声提取—固相萃取柱净化的前处理方法，可以有效去除蛋白质、氨基酸等杂质的影响，有利于提高提取效率和净化效果，得到较满意的结果。

2.1.1 蛋白沉淀剂的选择

蛋白沉淀剂的选择直接影响着后续HPLC法的分析性能。考察不同有机溶剂甲醇、丙酮、乙腈以及酸溶液、碱溶液对乳饮料样品的蛋白沉淀效果，实验结果如图1。单一选择有机溶剂进行蛋白沉淀时易出现分层现象，结合图1结果中回收率情况，加入2 mL 0.1 moL L-1三氯乙酸和30 mL乙腈进行蛋白沉淀，可以更有效的去除乳饮料中的蛋白质等杂质。

2.1.2 超声时间

在超声功率150W、温度25℃条件下，考察超声时间范围变化从5、7、10、13、15 min对回收率的影响。结果如图1，随着超声时间增加，样品中硫氰酸钠提取回收率随之增加，超声时间增加到一定时间后提取回收率无明显影响。因此选择10 min为最优超声时间。

图1 蛋白沉淀剂的影响Fig.1 Effectof protein precipitation agent

图2 超声时间的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time

图3 SPE类型的影响Fig.2 Effectof type of SPE cartridges

图4 柱温的影响Fig.4 Effectof column temperature

2.1.3 固相萃取柱类型

选择固相萃取柱的主要目的是净化，因为主要干扰硫氰酸钠检测的杂质包括蛋白质，脂肪、氨基酸和水溶性维生素。研究进一步考察HLB、MCX、Si、C18、C8（规格均为300mg，6mL）5种不同填料的SPE柱，结果如图3。结果表明C18柱对样品净化效果最好。

2.1.4 柱温的影响

色谱柱的柱温对硫氰酸钠的分离分析有一定的影响，升高柱温可以保留时间提前，分离效果变好，但是升高到一定程度后保留时间变化不明显，还会影响分离效果。见图4，最终选择35℃为最佳柱温。

2.2 方法评价

2.2.1 线性关系

以硫氰酸钠标准溶液浓度和所得色谱峰面积绘制标准曲线，得到线性回归方程；同时得到硫氰酸钠的检出限（LOD）和定量限（LOQ）。LOD和LOQ均由以下公式得到：

σ是11个空白样品直接引入到HPLC分析得到的信号的标准偏差，k是曲线的斜率。所得数据如表1。

表1 工作曲线和线性范围Table1 Working curves and Linear range

2.2.2 样品分析

通过评价方法的精密度和回收率分析5种乳饮料样品，（1）标准溶液、（2）空白样品1溶液、（3）加标样品1溶液、（4）牛奶样品2如图5所示。7种牛奶样品都检出硫氰酸钠，检出量数据如表2。

图5 标准溶液（1），空白溶液（2），加标样品溶液（3），样品溶液（4）的色谱图Fig.5 Chromatograms of standard solution（1），blank solution（2），spiked sample solution（3），sample solution（4）

表2 硫氰酸钠检出量Table2 Detectable amountof Sodium Thiocyanate

对于同一个样品分别加入两个不同浓度水平的标准溶液（2.00、20.00μg·kg-1），每一个样品一天内分析三次，求得日内精密度；三天内每天分析一次，求得日间精密度，都是由相对标准偏差（RSD）表示。

表3 牛奶样品的分析结果Table3 Analytical results of dairy samples

3 结论

建立了超声辅助萃取/固相萃取柱净化/高效液相色谱快速测定乳饮料中硫氰酸钠的方法，针对样品前处理技术进行研究，并对萃取、净化条件进行优化。3min完成硫氰酸钠的检测，并在0.05～50mg·kg-1范围内具有良好的线性，检测限为0.024mg·kg-1。经此方法检测5种乳饮料样品，（下均检出不同程度的硫氰酸钠残留，最高达到95.40mg·kg-1。经检测样品2—爽歪歪、3—AD钙奶、5—优酸乳疑似添加，饮用不安全。此方法前处理简单、分析快速，为乳饮料中硫氰酸钠的质量监控提供了可靠的检测手段。

[1]伍金娥，常超，胡海琼，等.紫外分光光度法测定掺假牛奶中的硫氰酸钠含量[J].武汉工业学院学报，2010，29（2）：1-3.

[2]顾欣，黄士新，李丹妮，等.乳中硫氰酸盐对人类健康的风险评估[J].中国兽药杂志，2010，44（9）：45-49.

[3]Kononova O N，Goryaeva N G，Kononov Y S，The sorption of thiocyanate ions on complex forming ionites[J].Zhurnal Fizicheskoi Khimii，2011，85（6）：1142-1147.

[4]Kozin L F，Danil’tsev B I.The Effect of sodium thiocyanate on the corrosion dissolution rate of silver in thiosemicarbazide solutions[J].Zashchita Metallov，2005，41（4）：372-380.

[5]Glatz z，NovákováS，sˇtěrbováH.Analysis of thiocya-nate in biological fluids by capillary zone electrophoresis[J].J.Chromatrogr.A，2001，916（1-2）：273-277.

[6]刘明.离子色谱法快速测定原料乳中硫氰酸盐含量的研究[J].安徽工程科技学院学报，2010，25（2）：47-49.

[7]水明，赵慧芬，曹燕淑.可见分光光度法测定牛乳中硫氰酸钠[J].中国奶牛，2009（11）：50-51.

[8]胡桂林，薛志清，张河霞，等.气相色谱法测定牛奶和奶粉中的硫氰酸盐[J].中国乳品工业，2010，38（10）：54-56.

[9]Shamsipur M，Ershad S，Samadi N，et al.The first use of a Rh（Ⅲ）complex as a novel ionophore for thiocyanateselective polymeric membrane electrodes[J].Talanta，2005，65（4）：991-997.

[10]张水锋，林珍珍，陈小珍，等.基于离子色谱/电导检测的全脂奶粉中硫氰酸盐污染物的测定及前处理方法研究[J].分析测试学报，2012，31（1）：85-89.

[11]张永峰，陈小珍，张东雷，等.离子色谱-电导检测法测定不同乳制品中硫氰酸盐[J].中国无机分析化学，2012，2（3）：60-63.

[12]宋洁，傅英文，杜利君，等.顶空进样-气相色谱法检测乳制品中硫氰酸盐的含量[J].色谱，2012，30（7）：743-746.

[13]张丽媛，姚笛，何莹，等.固相萃取-高效液相色谱法联用检测花椒样品中的玫瑰红B[J].黑龙江八一农垦大学学报，2012，24（6）：53-57.