红松松子壳多糖的单糖组成及结构初步分析

张曜武，丁 宁

（青岛科技大学化工学院，山东 青岛266042）

我国东北地区红松（Pinus koraiensis）资源丰富，其果实松子因具有较高的营养价值和保健功能而被广泛食用。从摘除松子后的松球鳞片中提取的松子壳多糖具有抗病毒[1－2］、抗肿瘤[3－4］、增强免疫[5］等多种生物活性，而多糖的活性又与其结构组成密切相关[6］，因此有必要对其单糖组成和结构特征进行分析。

作者将膜分离技术与离子交换纤维素柱层析联用，分别得到红松松子壳总多糖PPSPⅠ－b和其分离纯化组分PPSPⅠ－1，采用气相色谱仪测定多糖样品的单糖组成及其物质的量比，采用红外光谱仪对PPSPⅠ－1的结构特征进行初步分析，拟为红松松子壳多糖成分的深入研究提供参考。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

红松松子壳，青岛天元普康生物技术有限公司；DEAE－52离子交换纤维素，北京瑞达恒辉科技发展有限公司。

鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、氯仿、吡啶、肌醇、三氟乙酸、醋酸酐、甲醇、盐酸羟胺均为国产分析纯试剂。

98－1－B型电子调温电热套；SHZ－Ⅲ型循环水真空泵；80－2B型台式低速离心机；RE－52型旋转蒸发仪；T6新世纪紫外可见分光光度计；N－300型气相色谱仪（氢火焰离子检测器）；FTIR－480型红外光谱仪。

1.2 方法

1.2.1 混合单糖标准品溶液的制备[7］

单糖标准品衍生化：称取单糖标准品10mg，放入具塞试管中，加盐酸羟胺10mg、内标7mg、无水吡啶0.5mL，放入90℃水浴中加热30min并振荡使其完全溶解，取出后冷却至室温，加入醋酸酐0.5mL，在90℃下继续反应30min进行乙酰化，冷却后加入少量甲醇，旋蒸除掉溶剂，加入氯仿1mL重新溶解。

分别称取鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等6种单糖标准品各10mg，按上述方法进行衍生化处理，氯仿溶解，即得混合单糖标准品溶液。

1.2.2 红松松子壳多糖的提取、分离与纯化

称取一定量红松松子壳粉末，用15倍水提取3次，每次2h，合并提取液；经活性炭吸附、离心，再经微滤、超滤分离纯化，木瓜蛋白酶结合Sevage法脱蛋白，大孔吸附树脂脱色，醇沉，离心，得总多糖PPSPⅠ－b。

取一定量PPSPⅠ－b溶于蒸馏水，上样到已平衡的DEAE－52离子交换纤维素柱上，用蒸馏水洗脱，3，5－二硝基水杨酸法（DNS法）跟踪检测，根据洗脱曲线的主峰位合并收集液，透析，干燥，即得红松松子壳多糖纯化组分PPSPⅠ－1。

1.2.3 多糖样品的水解和衍生化[8］

称取红松松子壳多糖样品10mg，置于安瓿瓶中，加入4mol·L－1的三氟乙酸（TFA）2mL，振荡使其溶解，充氮气封管后于110℃水解3h；取出冷却后，将水解液减压蒸干，然后加少量甲醇溶解，再减压蒸干，重复上述操作4～5次以完全除尽TFA。

衍生化步骤同1.2.1。

1.2.4 色谱条件

HP－5型 毛 细 管 色 谱 柱 （30m×0.32mm，0.25 μm），载气为N2，检测器为FID，汽化室温度260℃，检测器温度260℃；程序升温：初温140℃保留5min；以2℃·min－1的速率升温至180℃，保留5min；以2℃·min－1的速率升温至210℃，保留10min。

1.2.5 红外光谱分析[9］

对纯化组分PPSPⅠ－1进行红外光谱分析：取干燥的PPSPⅠ－1样品2mg，以 KBr压片，在4 000～400 cm－1区间进行红外光谱扫描。

2 结果与讨论

2.1 红松松子壳多糖的单糖组成分析

混合单糖标准品溶液、红松松子壳总多糖PPSPⅠ－b和纯化组分PPSPⅠ－1的气相色谱见图1。

图1 混合单糖标准品（a）、PPSPⅠ－b（b）、PPSPⅠ－1（c）的气相色谱Fig.1 The gas chromatogram of mixed monosaccharide standard（a），PPSPⅠ－b（b），PPSPⅠ－1（c）

由图1a可知，6种标准单糖可以得到较好的分离。以肌醇为内标，在混合标准单糖衍生物中逐一加入标准单糖，根据相应色谱峰面积的变化，可鉴定出各单糖的出峰顺序依次为：鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。

由图1b可知，PPSPⅠ－b是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等单糖组成的杂多糖，其物质的量比为3.40∶1.40∶0.79∶7.82∶10.67∶18.35。

由图1c可知，PPSPⅠ－1是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等单糖组成的杂多糖，其物质的量比为0.96∶2.30∶2.97∶10.60∶6.91。在PPSPⅠ－b和PPSPⅠ－1色谱图保留时间为16min附近均有一个色谱峰，因缺乏相应的标准品未能鉴别归属。

2.2 红松松子壳多糖的结构分析

纯化组分PPSPⅠ－1的红外光谱见图2。

由图2可知，PPSPⅠ－1在1 000～1 200cm－1、2 800～3 000cm－1、3 200～3 500cm－1区域内均具有多糖的特征吸收峰。3 431.27cm－1处为分子间O－H伸缩振动吸收峰；2 933.33cm－1处为C－H伸缩振动吸收峰；1 629.58cm－1处为多糖的水合振动吸收峰；1 452.03cm－1处是C－H 变角振动吸收峰；1 040.48 cm－1处是吡喃糖环的醚键C－O－C的吸收峰，表明PPSPⅠ－1中的单糖是以吡喃糖的形式存在；806.34 cm－1处是α－端基差向异构的C－H变角振动吸收峰。

图2 PPSPⅠ－1的红外光谱Fig.2 The FTIR spectrum of PPSPⅠ－1

3 结论

采用膜分离技术对红松松子壳热水提取物进行分离纯化，经脱蛋白、脱色后得到总多糖PPSPⅠ－b，经DEAE－52离子交换纤维素柱层析分离得到纯化组分PPSPⅠ－1。PPSPⅠ－b主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成；PPSPⅠ－1主要由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成；PPSPⅠ－1的红外光谱中具有多糖特征吸收峰，显示其中存在吡喃糖和α－构型糖苷键。

[1]SAKAGAMI H，KONNO K，NONOYAMA M.Anti－HIV agents：US，4985249A[P］.1991－01－15.

[2]HARADA H，SAKAGAMI H，NAGATA K，et al.Possible involvement of lignin structure in anti－influenza virus activity[J］.Antiviral Res，1991，15（1）：41－49.

[3]吕永俊，王士贤，彭芳，等.松果有效成分研究.Ⅵ.红松与油松松塔及松子壳的抗癌活性[J］.大理学院学报（综合版），2008，7（2）：1－2.

[4]NAGASAWA H，IWAI Y，IWAI M，et a1.Suppression by apine cone extract of Pinus parviflora Sieb et Zucc of mammary tumour virus in milk of mice[J］.Anticancer Res，1992，12（3）：845－847.

[5]刘中禄，吕铁钢，张永亮.松子壳多糖对小鼠主要免疫细胞功能的影响[J］.中国比较医学杂志，2010，20（10）：33－37.

[6]张松，徐章荫.多糖类医药生物活性研究进展[J］.中国生化药物杂志，1996，17（6）：272－274.

[7]康学军，曲见松.白芷多糖中单糖组成的气相色谱分析[J］.药物分析杂志，2006，26（7）：891－894.

[8]邓颖琳.金针菇子实体多糖的提取、分离纯化及结构鉴定[D］.杭州：浙江工业大学，2011.

[9]柳红，张静.用气相色谱和红外光谱对羧甲基化南瓜多糖结构的研究[J］.光谱实验室，2008，25（3）：313－318.