荷叶总黄酮的水溶提取工艺优化研究

夏 宁，曾 庆，李晓瑾，刘立新，刘志伟

荷叶黄酮是荷叶的主要生物活性成分之一。研究表明，黄酮具有降血脂、降血压、抗菌、抗氧化等生理功能，广泛应用于医药领域[1－4］。作者在此对荷叶总黄酮水溶提取工艺进行优化，拟为水溶法提取荷叶总黄酮的规模化生产提供依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

荷叶由武汉华康臣生物科技有限公司提供。将产自武汉蔡甸区的干燥荷叶粉碎，过40目筛，备用。

芦丁标准品、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、碳酸钠、四硼酸钠，均为分析纯。

分光光度计，电热鼓风干燥箱，高速离心机，电子天平，恒温水浴锅，真空抽滤机，粉碎机。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的绘制

精密称取120℃干燥至恒质量的芦丁标准品10.0mg，加80%（体积分数，下同）乙醇溶解，定容至50mL容量瓶中，摇匀，得到总黄酮含量为0.2mg·mL－1的芦丁标准溶液。

准确吸取芦丁标准溶液 0.0mL、0.2mL、0.5 mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL于10mL比色管中，加入5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀；静置5min后加入10%硝酸铝溶液1mL，摇匀；静置5min后加入4%氢氧化钠溶液4mL，再用30%乙醇溶液定容至10mL，摇匀；静置15min后，于408nm波长处测定吸光度A。以芦丁总黄酮浓度c（mg·mL－1）为横坐标、以吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程。以未添加芦丁的相应溶液作空白对照。

1.2.2 提取方法

称取3.0g荷叶细粉，加入少量的助溶剂混合，然后加入一定量的蒸馏水，搅拌均匀；在不同温度下提取不同时间，自然冷却20min左右，经真空抽滤后蒸发浓缩；将浓缩液定容至100mL的容量瓶中，即得到供试品溶液。

由于荷叶黄酮类化合物主要是荷叶苷、槲皮素和异槲皮素，该类化合物含有酚羟基，所以在荷叶总黄酮水溶法提取过程中一般加入少量的硼酸作为助溶剂。本实验选用碳酸钠和四硼酸钠（1∶1，质量比）作为助溶剂，助溶剂总量占荷叶干质量的20%。

1.2.3 工艺优化

先分别考察料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，g∶mL，下同）、提取温度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃）和提取时间（5min、10min、15min、20min、25min、30min）对荷叶总黄酮得率的影响。再依据单因素实验结果，进行3因素3水平的正交实验，进一步优化工艺条件。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线与回归方程（图1）

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of lutin solution

对芦丁总黄酮浓度c（mg·mL－1）与吸光度A进行线性回归，得回归方程：A＝10.557c－0.0092，R2＝0.9995。

2.2 单因素实验结果分析

2.2.1 料液比对荷叶总黄酮得率的影响（图2）

图2 料液比对荷叶总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of solid－liquid ratio on yield of total flavonoids from lotus leaves

由图2可以看出，料液比为1∶40时的荷叶总黄酮得率最高，料液比过大或者过小都不利于总黄酮的提取。这是因为，料液比过小，总黄酮溶解不充分；料液比过大，不仅浪费溶剂，同时也会溶解大量的杂质，使后续的黄酮纯化工序更加复杂。因此，选择料液比为1∶40左右。

2.2.2 提取温度对荷叶总黄酮得率的影响（图3）

由图3可以看出，荷叶总黄酮得率随提取温度的升高先升高后缓慢降低，在提取温度为80℃时，达到最高。这可能是因为，总黄酮的结构在一定温度范围内是稳定的，当温度升高到某个程度，其结构可能会发生变化，致使总黄酮得率降低。一般来说，提取温度越高，分子运动越剧烈，溶解越快，物质更易溶出；但随着提取温度的进一步升高，黄酮类物质会被氧化导致其含量不再增加且可能下降。因此，选择提取温度为80℃左右。

图3 提取温度对荷叶总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on yield of total flavonoids from lotus leaves

2.2.3 提取时间对荷叶总黄酮得率的影响（图4）

图4 提取时间对荷叶总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of extraction time on yield of total flavonoids from lotus leaves

由图4可以看出，荷叶总黄酮得率在提取时间为20min时达到最高，表明长时间提取并不利于总黄酮得率的提高，而且容易使后续操作更加繁琐。因此，选择提取时间为20min左右。

2.3 正交实验结果分析

依据单因素实验结果，以料液比、提取温度、提取时间为考察因素，以荷叶总黄酮得率为考核指标，进行3因素3水平正交实验，以优化工艺条件。正交实验的因素与水平见表1 ，结果与分析见表2 。

表1 正交实验因素与水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

由表2 数据分析得出的优化方案是A2B1C3，而正交实验的4＃方案（A2B1C2）的总黄酮得率最高。因此，将优化方案与4＃方案重新进行对比实验，比较总黄酮得率，以筛选荷叶总黄酮的最优提取方案。

表2 L9（33）正交实验结果与分析Tab.2 Results and analysis of L9（33）orthogonal experiment

结果发现：按优化方案测得的总黄酮吸光度为0.743、0.751、0.758，平均值为0.751，小于4＃方案的吸光度（0.790）。因此，选择正交实验的4＃方案（A2B1C2）为荷叶总黄酮提取的最优方案，即料液比1∶50（g∶mL）、提取温度75℃、提取时间15min。

2.4 验证实验

传统方法：以50%乙醇溶液作为溶剂。取干荷叶3.0g，加50%乙醇150mL，搅拌均匀，常温下提取20 min。平行实验3次，测得荷叶总黄酮的平均得率为2.11%。

在最优工艺条件下进行3次验证实验，测得荷叶总黄酮的平均得率为2.49%，较传统方法提高0.38%。

3 结论

通过单因素实验和正交实验确定水溶法提取荷叶总黄酮的最佳工艺条件为：料液比1∶50（g∶mL）、提取温度75℃、提取时间15min，在此条件下，荷叶总黄酮的平均得率达到2.49%，较传统方法提高0.38%。

[1]蔡为荣.微波提取荷叶黄酮及其清除羟基自由基的研究[J］.食品科学，2004，25（9）：112－115.

[2]钟先锋，黄桂东.荷叶成分及功能的研究进展[J］.食品与机械，2006，22（4）：138－140.

[3]王洋.机械化学法在植物有效成分提取中的应用[D］.大连：辽宁师范大学，2008.

[4]陈海光，余以刚，曾庆孝.荷叶黄酮及生物碱的提取研究[J］.食品科学，2003，23（1）：69－72.