17β-雌二醇对小鼠肺成纤维细胞细胞周期的影响*

王 悦，计阿丹，肖永红

河北联合大学公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室 唐山 063000

矽肺是我国目前常见且危害性严重的一种职业病，临床表现主要为肺部弥漫性纤维化。肺纤维化最显著的特点是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)大量合成，降解受到抑制，造成富含胶原的ECM大量沉积，形成纤维化。现有研究[1]表明小凹蛋白(caveolin-1)是细胞膜上信号分子富集区-质膜囊泡结构的主要功能性结构蛋白，它穿梭于胞质与胞膜之间，结合胞内的信号转导分子，负性调节信号传导，从而抑制胶原的沉积以及肺纤维化的发展。17β-雌二醇(17β-estradiol，17β-E2)可以诱导小凹蛋白的表达，提示17β-E2可能参与了肺纤维化的过程[2]。作者观察了17β-E2对小鼠肺成纤维细胞细胞增殖和细胞周期的影响，以期为肺纤维化的治疗提供新的途径和方法。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠肺成纤维细胞株L929细胞(上海博谷生物公司)于液氮中存储。将17β-E2(北京博奥森生物公司)溶解于二甲基亚砜(DMSO)，制成浓度为10－2mol/L的母液，然后用无血清RPMI 1640培养液稀释成浓度为 10－6、10－7、10－8mol/L 的药液，4℃储存备用。将游离SiO2颗粒(95%以上的颗粒直径＜5 μm，购于中国预防科学院劳卫所)充分研磨后于180℃干烤6 h，用无血清RPMI 1640培养液配成SiO2质量浓度为20、50、100 mg/L的溶液，4℃储存。胎牛血清(杭州四季青公司)56℃水浴30 min灭活，4℃存储备用。PBS缓冲液(北京四正柏生物公司)、DMSO(美国Sigma公司)常温存放。四甲基偶氮唑盐(MTT，购于美国Sigma公司)粉剂经无菌PBS配置成浓度为5 mg/L的溶液，－20℃存储备用。碘化丙啶(PI)荧光染料(杭州联科生物公司)，4℃储存;RNA酶(杭州联科生物公司)，－20℃存放。EPICS®ALTRATM型流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)，318MC型酶联免疫检测仪(上海精科公司)。

1.2 L929细胞的培养 利用无菌超净台配制含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和链霉素的RPMI 1640完全培养液。快速取出液氮中保存的小鼠肺成纤维细胞于37℃水浴箱复苏，接种于完全培养液中，于37℃、含体积分数5%CO2培养箱中培养，24 h后换液，以防止残留的DMSO影响细胞的正常生长。

1.3 17β-E2对SiO2诱导的L929细胞增殖影响的观察 采用 L9(33)正交实验[3]，分析不同浓度SiO2、17β-E2及其干预时间3个因素对L929细胞增殖的影响。实验因素及水平设定见表1。实验共分为9组，每组设6个复孔。倒置显微镜下见细胞贴壁、形态良好并呈单层致密状时，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化，制成密度为1×106mL－1的细胞悬液，按每孔200 μL接种在96孔板上，置于37℃、含体积分数5%CO2培养箱中培养，待细胞覆盖面积达培养瓶80%左右时加入无血清RPMI 1640培养液同步化24 h。每组先加入相应剂量的SiO2诱导24 h，然后加入相应浓度17β-E2作用相应的时间，最后使用MTT法测定细胞增殖率。酶联免疫检测仪测定波长为490 nm。根据实验结果，筛选出细胞增殖抑制效果较明显(吸光度值较低)的实验条件用于后续实验。

表1 SiO2和17β-E2对 L929细胞增殖影响的正交实验设计表

1.4 17β-E2对SiO2诱导的L929细胞周期分布影响的观察 实验分成3组:空白对照组，SiO2诱导组，17β-E2干预组。选取对数生长期的L929细胞，胰酶消化，配制成细胞悬液，按1×106mL－1的密度接种于培养瓶中，于37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，待细胞贴壁且呈单层致密状，用无血清培养基同步化24 h，再分组处理。空白对照组常规培养;SiO2诱导组应用实验用浓度的SiO2诱导细胞24 h;17β-E2干预组细胞经SiO2诱导24 h后，用实验用剂量的17β-E2干预相应时间。处理完成后，3组细胞经2.5 g/L胰酶消化，收集并高速离心5 min，去除培养液，用PBS冲洗1次，加入体积分数70%的冰乙醇4℃固定过夜。第2天离心去除固定液并重新用PBS悬浮细胞5 min，再次离心弃PBS后加入 400 μL PBS、40 μL PI和 2 μL RNA 酶室温避光孵育10 min，然后上流式细胞仪检测细胞周期。重复3次。

1.5 统计学处理 运用SPSS 19.0进行统计学分析。采用正交实验筛选出最佳实验条件;3组细胞周期分布的比较采用单因素方差分析和LSD-t法检验，检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 细胞增殖实验结果 细胞增殖率测定、分析结果见表2、3。从表2、3可以看出，最佳实验条件筛选结果为:应用20 mg/L SiO2诱导，用10－6mol/L的17β-E2干预24 h。

2.2 细胞周期测定结果 见表4。可以看出，SiO2诱导组小鼠肺成纤维细胞G1期细胞比例较空白对照组降低，S+G2期细胞比例升高;而17β-E2干预组G1期细胞比例较SiO2诱导组升高，S+G2期细胞比例降低(P ＜0.05)。*:与空白对照组比较，P＜0.05;#:与SiO2诱导组比较，P＜0.05。

表2 SiO2和17β-E2对 L929细胞增殖影响的正交实验及极差分析结果

表3 单因素方差分析结果

表4 各组L929细胞周期测定结果 %

3 讨论

肺成纤维细胞是肺纤维化过程中的重要细胞，它们具有合成胶原蛋白和纤维的能力[4]。肺成纤维细胞在受到游离SiO2诱导下过度增生，就会大量分泌胶原蛋白，进而引起ECM大量合成和过度沉积，最终导致肺纤维化[5]。现有研究[6]表明女性肝硬化的发病率明显低于男性，提示雌激素在纤维化过程中可能起保护作用，而17β-E2作为女性体内活性最强的雌激素，可能具有抗纤维化的作用。17β-E2可增加小鼠肺成纤维细胞内小凹蛋白的表达，而小凹蛋白又能抑制信号分子的活化，如MEK、ERK、JNK、PI3K 和 Akt等，进而抑制胶原合成[7]。有研究[8]表明17β-E2对细胞增殖具有双重效应:低浓度17β-E2通过影响Cyclin D1的表达，促使细胞由G1期转换到S期;高浓度17β-E2则通过影响Bax蛋白的表达选择性诱导G2/M期细胞的凋亡。周期分布可直接反映细胞的增殖情况。

该研究利用L9(33)正交实验观察17β-E2对SiO2诱导的L929细胞增殖的影响，筛选出20 mg/L SiO2诱导24 h，然后用10－6mol/L 17β-E2 干预24 h的实验条件。然后，在该实验条件下，作者观察了L929细胞周期分布的变化。结果显示，SiO2诱导组小鼠肺成纤维细胞G1期细胞比例较空白对照组降低，S+G2期细胞比例升高;而17β-E2干预组G1期细胞比例较SiO2诱导组升高，S+G2期细胞比例降低。上述结果提示17β-E2可以提高肺成纤维细胞细胞周期中G1期细胞的比例，减少S期和G2期细胞的比例，有效阻抑细胞由G1期进入G2和S期，从而抑制小鼠肺成纤维细胞的增殖。

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